[發明專利]一種基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法

在審

• 申請號: 202210363235.1
• 申請日: 2022-04-07
• 公開（公告）號: CN114839381A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 馮致遠;張晶晶
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;C12N15/115;C12N15/113
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 冒艷

1.一種基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)基于標記有cTnI抗體的酶標板，結合待測物中的cTnI，孵育形成抗體-cTnI復合物；

(2)兩條ssDNA退火形成雙鏈cTnI DNA適配體；

(3)適配體與cTnI-抗體復合物孵育，結合形成抗體-cTnI-適配體三元夾心結構；

(4)抗體-cTnI-適配體三元夾心結構與T7 RNA聚合酶Mix混合，通過識別雙鏈DNA適配體的T7啟動子序列啟動轉錄合成激活子RNA；

(5)CRISPR Cas13d蛋白與crRNA按比例混合，錨定形成Cas-crRNA核糖核酸復合物；

(6)向步驟(4)的產物中加入核糖核酸復合物和熒光信號報告分子，Cas-crRNA核糖核酸復合物可特異性識別激活子RNA，激活Cas蛋白的側切活性并切割熒光報告分子，檢測相關動力學和終點熒光值。

2.根據權利要求1所述的基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特征在于：

crRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGCACTGGTGCAA

SEQ ID NO.1ATTTGCACTAGTCTAAAACTCCATGATTTCCTCCGCGATCATT

crRNA-R：AATGATCGCGGAGGAAATCATGGAGTTTTA

SEQ ID NO.2GACTAGTGCAAATTTGCACCAGTGCCTATAGTGAGTCGT ATTA。

3.根據權利要求1所述的基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特征在于：

crRNA GGCUACUACACUGGUGCAAAUUUGCACU

SEQ ID NO.3AGUCUAAAACUCAUCCACUUCCACAGCGGGUGGGCGUC。

4.根據權利要求1所述的基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特征在于：

cTnI-F CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCT

SEQ ID NO.4GCCCCTCTTATAATACGACTCACTATAGGTCGAATGATCGCGGAGGAAATCATGGAAATCCACA

cTnI-R TGTGGATTTCCATGATTTCCTCCGCGATCAT

SEQ ID NO.5TCGACCTATAGTGAGTCGTATTA。

5.根據權利要求1所述的基于CRISPR Cas13d檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特征在于：所述步驟(5)所述的CRISPR Cas13d蛋白表達采用pET28a-MH6-RspCas13d質粒轉入大腸桿菌表達載體DE3感受態細胞BL21實現。