[發明專利]用于單細胞測序的蜜蜂大腦單細胞懸液的制備方法

在審

• 申請號: 202210361708.4
• 申請日: 2022-04-07
• 公開（公告）號: CN114574424A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 劉永軍;柯俐;代平禮;陳夏桑
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 北京知呱呱知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍

本發明公開了一種用于單細胞測序的蜜蜂大腦單細胞懸液的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：向蜜蜂大腦組織中加入蛋白酶溶液，充分分解后，獲得蜜蜂大腦組織混合物；所述蜜蜂大腦組織混合物經過濾后，收集大腦組織混合物濾液；將所述大腦組織混合物離心后，獲得沉淀物，將所述沉淀物重懸后，離心，獲得的沉淀用緩沖液重懸，獲得蜜蜂大腦單細胞懸液；其中，所述蛋白酶溶液中含liberse TM酶和木瓜酶。本發明的蜜蜂大腦單細胞懸液的制備方法，第一次將蜜蜂大腦單細胞進行分離，分離的單細胞純度高，活性強，雜質碎片少，分離獲得的蜜蜂大腦單細胞用于單細胞測序具有很好的效果。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種用于單細胞測序的蜜蜂大腦單細胞懸液的制備方法。

背景技術

蜜蜂不僅作為重要的農業昆蟲在世界范圍被廣泛飼養，其獨特的生殖現象和復雜的社會性行為也使得蜜蜂成為優秀的昆蟲研究模型。意大利蜜蜂(Apis mellifera)作為社會性昆蟲，在具備昆蟲特征的同時，還具有明顯的群體生物學的行為特點，對于人類的學習記憶能力和社會行為的研究是極為重要的模型。蜜蜂是農業網絡中的關鍵物種，表現出極強的發育可塑性，具體體現在級型分化和社會分工的調控方面。雖然蜜蜂的遺傳學操作(如基因編輯、遺傳學雜交等)存在諸多困難，至今仍難以實現類似于果蠅中大規模篩選突變體的實驗，但這并不影響蜜蜂逐漸成為表觀遺傳學和行為學研究的熱點。

蜜蜂擁有體積僅約為1立方毫米的大腦，盡管大腦體積小，但在處理復雜的環境信息和調控豐富的行為能力上發揮了決定性作用。與其他昆蟲一樣，蜜蜂的腦組織可劃分為前腦、中腦和后腦三部分。在蜜蜂中，前腦是大腦中最重要的也是所占體積最大的部分，由蕈形體(又稱蘑菇體)、中心復合體、視葉和側前腦等多種重要感覺結構組成，其中蕈形體是負責學習與記憶的高級中樞，處理來自初級中樞的各種感覺刺激。

盡管蜜蜂的大腦體積小，但少量的大腦神經細胞控制著大量的復雜行為。隨著生物遺傳學的發展，使人們可以從分子水平上了解蜜蜂學習記憶的機制，而對蜜蜂學習記憶相關基因及功能的研究即為一種有效的手段，對于明確其學習記憶的分子機制具有重要作用。

綜上，如何獲取蜜蜂的大腦組織的單細胞懸液，有助于提供從分子角度去研究蜜蜂的記憶機制以及相關生物學行為。

發明內容

為此，本發明提供一種用于單細胞測序的蜜蜂大腦單細胞懸液的制備方法。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明實施例提供一種用于單細胞測序的蜜蜂大腦單細胞懸液的制備方法，所述方法包括以下步驟：

向蜜蜂大腦組織中加入蛋白酶溶液，充分分解后，獲得蜜蜂大腦組織混合物；

所述蜜蜂大腦組織混合物經過濾后，收集大腦組織混合物濾液；

將所述大腦組織混合物離心后，獲得沉淀物，將所述沉淀物重懸后，離心，獲得的沉淀用緩沖液重懸，獲得蜜蜂大腦單細胞懸液；

其中，所述蛋白酶溶液中含liberse TM酶和木瓜酶。

本發明的一個實施例中，所述蛋白酶溶液中，liberse TM酶的濃度為12-14U/ml。

本發明的一個實施例中，所述蛋白酶溶液中，木瓜酶的濃度為3-5mg/ml。

本發明的一個實施例中，所述重懸液為含質量百分數為9-11％％FBS的DMEM培養基。

本發明的一個實施例中，所述過濾采用40μm細胞篩過濾。

本發明的一個實施例中，所述大腦組織混合物離心條件為：4℃，300RCF，離心10min。

本發明的一個實施例中，所述蜜蜂大腦組織的分解條件為37℃水浴，10-30min，冷卻至室溫，同時上下顛倒蜜蜂大腦組織混合物。