[發明專利]一種Ⅰ型副流感病毒、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒的多重富集檢測方法

在審

• 申請號: 202210353127.6
• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114891924A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 陶曄琪;曹玉婷;張苗雷;郭興中;陳文;朱小娟
• 申請（專利權）人: 杭州丹威生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/577;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 杭州君銳知產專利代理事務所(普通合伙) 33443
• 代理人: 方琦

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種Ⅰ型副流感病毒、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒的多重富集檢測方法。該方法包括如下步驟：S1、免疫磁珠的制備：將Ⅰ型副流感病毒、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒三種抗體分別偶聯至羧基修飾的超順納米磁珠上，得到三種偶聯病毒抗體的免疫磁珠；S2、病毒的富集：將Ⅰ型副流感病毒陽性或Ⅲ型副流感病毒陽性或呼腺病毒陽性的樣本保存液，與三種偶聯病毒抗體的免疫磁珠混合孵育；S3、用磁性工具分離免疫磁珠?病毒復合物，將免疫磁珠?病毒復合物重懸于TE緩沖液中加熱裂解；S4、用磁性工具分離磁珠，得到富集濃縮的病毒，用多重熒光PCR試劑對裂解產物中的液體直接進行檢測。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重富集檢測方法。

背景技術

WHO數據顯示，呼吸道感染是全球第四大致死原因，是中國5歲以下兒童的第三大死因。流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和人冠狀病毒是引起成人急性呼吸道感染的主要病原體。2021年3月1日，國家衛健委醫管局印發《2021年國家醫療質量安全改進目標》，針對當前醫療質量安全領域突出或者共同存在的薄弱環節和關鍵領域，提出了33項改進目標。其中第六項指出，呼吸道感染病原譜復雜，部分可引起流行，應提高呼吸道病原體核酸檢測率。其中流感病毒和呼吸道合胞病毒是嬰幼兒、老年人和存在心肺基礎疾病的患者重癥下呼吸道感染及其死亡的首要致病原。

人副流感病毒(human parainfluenza virus，HPIV)為無節段單負鏈RNA病毒，全長約15 000個核苷酸，屬副黏病毒科，HPIVs分為HPIV1-4四個血清型，其中HPIV-4又分為HPIV-4A和HPIV-4B兩種亞型，HPIV-1和HPIV-3為呼吸道病毒屬(respirovims)，HPIV-2和HPIV-4為腮腺炎病毒(mbulavirus)。HPIVs是繼呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus，RSV)后引起兒童急性呼吸道感染的又一常見病毒，有研究顯示，人副流感病毒引起的急性呼吸道疾病在兒童呼吸道患者中可高達40％，會引起哮喘，毛細支氣管炎，肺炎等較嚴重的臨床癥狀。此外，人副流感病毒在老年人和免疫功能不全人群中也會引起嚴重的下呼吸道疾病。

腺病毒屬于雙鏈DNA病毒，可長期存在于人群中，造成急性發熱性呼吸道感染的大規模流行。目前已發現的腺病毒包括7個亞群(A-G)，67個型別，其中對人類具有致病性的有55個血清型，可感染呼吸道、胃腸道、尿道、膀胱、眼和肝臟等，并引起廣泛的臨床癥狀，但呼吸道腺病毒更為常見，其中可導致呼吸道感染的腺病毒包括腺病毒3型、7型、11型、14型、21型、55型等，3型、7型、55型在我國較為常見。腺病毒感染臨床癥狀主要為發熱、咽部充血、咽痛、咳嗽、身體酸痛乏力較多，少數患者可有腹瀉、腹痛等胃腸道癥狀。

目前臨床檢驗中應用的針對副流感和腺病毒病毒的方法主要是多種病毒核酸聯合檢測方法，大多包含是6種及以上病毒檢測，如呼吸道病毒核酸六重聯檢試劑盒(PCR熒光探針法)等，項目的收費比較高。但目前所應用的熒光PCR檢測方法，作為一種酶促反應，仍然存在樣本處理繁瑣、對核酸純度要求高、PCR檢測時間偏長、自動化成本偏高等缺點，另外在血篩等臨床檢驗中現有的檢測方法也無法滿足其靈敏度的要求；以上的不足導致目前針對副流感和腺病毒的熒光PCR檢測方法在臨床檢驗中的應用受到了限制，尤其無法滿足門診和急診的需求。

發明內容

本發明的目的是提供一種I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重富集檢測方法，以解決現有檢測技術中存在的樣本處理繁瑣、對核酸純度要求高、PCR檢測時間偏長、自動化成本偏高等缺點。

基于上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種用于I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重熒光PCR檢測的引物探針組合物，該組合物包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，具體是(表1)：

表1