[發明專利]一種Ⅰ型副流感病毒、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒的多重富集檢測方法

在審

• 申請號: 202210353127.6
• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114891924A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 陶曄琪;曹玉婷;張苗雷;郭興中;陳文;朱小娟
• 申請（專利權）人: 杭州丹威生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/577;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 杭州君銳知產專利代理事務所(普通合伙) 33443
• 代理人: 方琦

1.一種用于I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重熒光PCR檢測的引物探針組合物，其特征在于該組合物包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，具體是：

2.一種用于I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重熒光PCR檢測的試劑盒，該試劑盒包含權利要求1所述的引物探針組合物。

3.一種I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒的多重富集檢測方法，該方法用于非疾病診斷目的，其特征在于該方法包括如下步驟：

S1、免疫磁珠的制備：將I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒三種抗體分別偶聯至羧基修飾的超順納米磁珠上，得到三種偶聯病毒抗體的免疫磁珠；

S2、病毒的富集：將I型副流感病毒陽性或III型副流感病毒陽性或呼腺病毒陽性的樣本保存液，與三種偶聯病毒抗體的免疫磁珠混合孵育，得到免疫磁珠-病毒復合物；

S3、用磁性工具分離免疫磁珠-病毒復合物，將免疫磁珠-病毒復合物重懸于TE緩沖液中加熱裂解；

S4、用磁性工具分離磁珠，得到富集濃縮的病毒，用多重熒光PCR試劑對裂解產物中的液體直接進行檢測；該多重熒光PCR試劑包含權利要求1所述的引物探針組合物。

4.根據權利要求3所述的多重富集檢測方法，其特征在于：步驟S4所述熒光PCR試劑(20μL)包含以下組分：如SEQ ID No：1至SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的引物，終濃度0.2μM；如SEQ ID No：3至SEQ ID No：5所示的核苷酸序列的引物，終濃度0.3μM；如SEQ ID No：6所示的核苷酸序列的引物，終濃度0.13μM；如SEQ ID No：7至SEQ ID No：9所示的核苷酸序列的引物，終濃度0.3μM；如SEQ ID No：10所示的核苷酸序列的引物，終濃度0.2μM；如SEQ IDNo：11至SEQ ID No：13所示的核苷酸序列的引物，終濃度0.1μM。

5.根據權利要求3所述的多重富集檢測方法，其特征在于：步驟S4所述熒光PCR試劑(20μL)包含以下組分：DNA聚合酶及逆轉錄酶混合液2μL/份，5×Reaction Buffer(含鎂離子及dNTP)6μL/份。

6.根據權利要求3所述的多重富集檢測方法，其特征在于：步驟S1所述I型副流感病毒、III型副流感病毒和腺病毒三種抗體均為單克隆病毒表面抗體。

7.根據權利要求3所述的多重富集檢測方法，其特征在于：步驟S2所述病毒的富集具體方法為：取樣本保存液200μL與三種偶聯病毒抗體的免疫磁珠各5μL混合，25-37℃混勻6-15分鐘。

8.根據權利要求3所述的多重富集檢測方法，其特征在于：步驟S3所述的加熱裂解是：在85-95℃加熱5-15分鐘裂解病毒釋放核酸。

9.根據權利要求3所述的多重富集檢測方法，其特征在于：PCR擴增反應條件：52℃持續15min；95℃持續1min；(95℃持續5s；58℃持續30s并采集熒光)45個循環。

10.根據權利要求3所述的多重富集檢測方法，其特征在于：所述超順納米磁珠直徑為200nm-350nm，表面帶有羧基(-COOH)基團；所述免疫磁珠制備具體為：利用EDC活化法將單克隆表面抗體連接到表面帶羧基(-COOH)的超順納米磁珠表面，并用BSA對偶聯了抗體后的磁珠進行封閉；

所述免疫磁珠所偶聯的病毒抗體為指I型副流感病毒HN抗體、III型副流感病毒HN抗體、腺病毒Hexon蛋白抗體，是單克隆抗體或多克隆抗體。