[發(fā)明專利]一種在微流場中利用烯還原酶生成（S）-2-甲基環(huán)己酮的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210348560.0
• 申請日: 2022-04-01
• 公開（公告）號: CN114875106A
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭凱;王雨清;胡玉靜;陳杰;趙明業(yè);王合永;黃桂翔;潘婕;咸漠
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P7/26;C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N11/089;C12N11/18;C12N9/04
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 肖明芳

1.一種在微流場中利用烯還原酶生成（S）-2-甲基環(huán)己酮的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：以2-甲基環(huán)己酮為原料，將固定在樹脂上的野生型烯還原酶固定在第一微通道中，利用野生型烯還原酶催化的脫氫拆分反應(yīng)，在第一微通道中將（R）-2-甲基環(huán)己酮催化成2-甲基-2-環(huán)己烯-1-酮；

S2：將工程化的烯還原酶和葡萄糖脫氫酶吸附在樹脂上作為生物催化劑固定到第二微通道中，注射步驟S1得到的反應(yīng)液到第二微通道，并連續(xù)添加NADP⁺和葡萄糖，將2-甲基-2-環(huán)己烯-1-酮還原得到（S）-2-甲基環(huán)己酮。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，所述野生型烯還原酶為來源于Thermus scotoductus SA-01的TsER。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中，所述工程化烯還原酶為來源于Thermus scotoductus SA-01的TsER的突變株TsER C25G/I66T。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，TsER的制備方法如下：將核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烯還原酶TsER的基因構(gòu)建到pET-28a（+）載體上，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL 21（DE 3）中，培養(yǎng)并純化得到對應(yīng)的烯還原酶TsER。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，烯還原酶吸附在樹脂上固定的方法為：將培養(yǎng)并純化得到的烯還原酶分散于浸有樹脂的磷酸鹽緩沖液中，于20~22℃下緩慢攪拌后，取出樹脂，于-80℃冷凍12 h，而后于凍干機中除水，將干燥的固定化樹脂填充到微通道中。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中，反應(yīng)溶劑為PBS緩沖液與有機溶劑的混合物，所述有機溶劑為正庚烷、異辛烷、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二甲基亞砜中的任意一種或幾種；其中，有機溶劑的體積小于等于反應(yīng)溶劑總體積的百分之一。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1和S2中，所述樹脂為水性吸附樹脂ES-1、ES-103B和ES-108中的任意一種；樹脂、純酶的用量比為400~1300 mg：126 μg。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1和S2中，反應(yīng)的溫度為25~35℃，反應(yīng)的停留時間為15~60 min。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中，所述的GDH為來源于芽孢桿菌的商業(yè)化酶。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1和S2中所述2-甲基環(huán)己酮、TsER、TsER C25G/I66T、GDH用量比為5~20 mM：3~5 mg：3~5 mg：30~50 U。