[發(fā)明專利]一種在微流場(chǎng)中利用烯還原酶生成（S）-2-甲基環(huán)己酮的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210348560.0
• 申請(qǐng)日: 2022-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114875106A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭凱;王雨清;胡玉靜;陳杰;趙明業(yè);王合永;黃桂翔;潘婕;咸漠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P41/00
• 分類號(hào): C12P41/00;C12P7/26;C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N11/089;C12N11/18;C12N9/04
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發(fā)明公開(kāi)了一種在微流場(chǎng)中利用烯還原酶生成（S）?2?甲基環(huán)己酮的方法，包括如下步驟：S1：利用（R）?選擇性的烯還原酶催化非天然反應(yīng)?脫氫反應(yīng)，拆分消旋的2?甲基環(huán)己酮得到2?甲基?2?環(huán)己烯?1?酮和（S）?2?甲基環(huán)己酮；S2：利用（S）?選擇性的烯還原酶催化天然反應(yīng)?還原反應(yīng)，還原2?甲基?2?環(huán)己烯?1?酮得到（S）?2?甲基環(huán)己酮。本發(fā)明利用兩步酶組合催化將消旋的2?甲基環(huán)己酮去消旋化得到難合成的（S）?2?甲基環(huán)己酮，具有反應(yīng)條件溫和、可持續(xù)性強(qiáng)、產(chǎn)物收率高、光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于化學(xué)合成技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種在微流場(chǎng)中利用烯還原酶生成(S)-2-甲基環(huán)己酮的方法。

背景技術(shù)

(S)-2-甲基環(huán)己酮是非常重要的藥物前體，可以用來(lái)合成許多高附加值藥物中間體，在醫(yī)藥合成領(lǐng)域的具有一定的應(yīng)用潛力。然而，目前合成(S)-2-甲基環(huán)己酮的方法中多有金屬氫化物介導(dǎo)、Pd配體參與、極端溫度和/或極端pH等苛刻條件。由于金屬催化劑的毒性，并且這些苛刻條件給(S)-2-甲基環(huán)己酮的合成帶來(lái)挑戰(zhàn)，越來(lái)越多的科學(xué)家致力于研究高效綠色合成(S)-2-甲基環(huán)己酮方法。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種在微流場(chǎng)中結(jié)合烯還原酶及其突變株對(duì)消旋的2-甲基環(huán)己酮去消旋化合成(S)-2-甲基環(huán)己酮的方法(圖1)。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明設(shè)計(jì)的反應(yīng)裝置如圖2所示。以消旋的2-甲基環(huán)己酮為原料，固定化的烯還原酶作為生物催化劑進(jìn)行催化，主要分為兩個(gè)反應(yīng)步驟：首先利用野生型烯還原酶催化的非天然反應(yīng)-脫氫拆分反應(yīng)，將(R)-2-甲基環(huán)己酮脫氫生成2-甲基-2-環(huán)己烯-1-酮；在提供輔酶循環(huán)的條件下，再利用工程化烯還原酶催化2-甲基-2-環(huán)己烯-1-酮還原得到(S)-2-甲基環(huán)己酮。

具體地，所述反應(yīng)包括如下步驟：

S1：以2-甲基環(huán)己酮為原料，將固定在樹(shù)脂上的野生型烯還原酶固定在第一微通道中，利用野生型烯還原酶催化的脫氫拆分反應(yīng)，在第一微通道中將(R)-2-甲基環(huán)己酮催化成2-甲基-2-環(huán)己烯-1-酮；

S2：將工程化的烯還原酶和葡萄糖脫氫酶(GDH)吸附在樹(shù)脂上作為生物催化劑固定到第二微通道中，注射S1反應(yīng)液到第二微通道，并連續(xù)添加NADP⁺和葡萄糖，將2-甲基-2-環(huán)己烯-1-酮還原得到(S)-2-甲基環(huán)己酮。

步驟S1中，所述烯還原酶TsER的制備方法如下：將核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烯還原酶TsER的基因構(gòu)建到pET-28a(+)載體上，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL 21(DE3)中，培養(yǎng)并純化得到對(duì)應(yīng)的烯還原酶TsER。

其中，SEQ ID NO.1是通過(guò)對(duì)序列號(hào)為Q5SLY6的序列改良而來(lái)，Q5SLY6序列總長(zhǎng)1050，可以在NCBI上搜索得到。SEQ ID NO.1序列總長(zhǎng)1059，其中，前端三個(gè)堿基屬于限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，后端六個(gè)也是限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

步驟S1中，反應(yīng)的溶劑為磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液，50mM，pH 7.4)與有機(jī)溶劑的混合物，所述有機(jī)溶劑包括但不限于正庚烷、異辛烷、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二甲基亞砜；其中，有機(jī)溶劑的體積小于等于反應(yīng)總體積的百分之一。

步驟S1中，所述野生型烯還原酶為來(lái)源于Thermus scotoductus SA-01的TsER。

步驟S2中，所述工程化烯還原酶為來(lái)源于Thermus scotoductus SA-01的TsER的突變株TsER C25G/I66T，突變的思路可參照期刊ChemBioChem.2017,18(7),685-691。