[發明專利]唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測引物組、試劑盒以及凍干微球的制備方法

在審

• 申請號: 202210345971.4
• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114525324A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 許世偉;許遠;邵俊影;吳鎮宇;王欣;林圣博
• 申請（專利權）人: 河南冠宇儀器有限公司;河南中檢食安生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;F26B5/06
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 錢學宇

本發明公開了一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測引物組、試劑盒以及凍干微球的制備方法，屬于核酸檢測領域。該檢測引物組針對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的16S～23S rRNA保守序列設計，檢測引物組包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF和環引物LB。包含這種檢測引物組的凍干微球的制備方法包括：將上述檢測引物組與LAMP反應基液混合，得到擴增反應體系；將擴增反應體系與凍干保護劑混合，逐滴滴入液氮中速凍成球后，冷凍干燥。這種檢測方法，利用上述凍干微球，能夠簡單、高效的檢測出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌存在與否，進而判斷出檢測樣本中是否含有米酵菌酸毒素，特異性強，不易出現假陽性。

技術領域

本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測引物組、試劑盒以及凍干微球的制備方法。

背景技術

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌為革蘭氏陰性短桿菌、兩端鈍圓，無牙孢，有鞭毛，在自然界分布廣泛。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌為兼性厭氧，易在食品表面生長。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌可以產生米酵菌酸引起食物中毒，唐菖蒲伯克霍爾德氏菌不耐高溫，很容易被高溫殺死，但是它所產生的“米酵菌酸”毒素耐熱，一般烹調方法不能破壞其毒性。由于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌食物中毒流行規模較大、發病率和病死率極高，而且目前缺乏特效的解毒措施。因此唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的檢測方法是否靈敏、快速至關重要。

目前米酵菌酸的檢測方法的依據是GB 5009.189-2016《食品安全國家標準食品中米酵菌酸的測定》，用的是高相液相色譜法檢測，檢測的儀器及試劑成本非常相對較高，除此以外也有用薄層層析、紫外分光光度、ELISA、膠體金試紙條等方法檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌所產生的外毒素的。這些方法雖然操作相對簡單一些，但很容易出現假陽性現象。

環介導恒溫擴增技術是一種不需要精確控溫過程的基因診斷技術，借助6條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，可在等溫條件下快速，高特異性和靈敏的擴增靶序列，檢測全過程只需要在60-65℃條件下擴增40-60min，具有操作簡單、反應時間短、特異性高、靈敏度高等特點，廣泛應用于病原菌檢測領域。

環介導恒溫擴增法結果判讀方法主要有1：濁度法，可通過反應后肉眼觀察是否存在白色絮狀沉淀，判定檢測結果，主觀因素較強，靈敏度低。2、顯色法，反應結束后加入核酸染料SYBR GREEN、HNB、鈣黃綠素等，在紫外燈或肉眼條件下顯示不同的顏色，結果判定簡單，但需要反應結束后開蓋，極易造成氣溶膠污染。3、熒光檢測法，該方法通過向反應體系中加入熒光染料SYBR GREEN，通過熒光PCR儀可實時觀察體系中熒光變化，生成熒光曲線，通過曲線觀察擴增結果，該方法閉管檢測，杜絕氣溶膠污染，但因SYBR GREEN染料特性，能和任意的雙鏈DNA結合，并發生熒光，特異性低易出現假陽性。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測引物組，該引物組針對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的保守序列16S～23S rRNA設計，能夠特異性的識別唐菖蒲伯克霍爾德氏菌，特異性強。

本發明的第二目的在于提供一種用于檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的凍干微球的制備方法，該方法采用凍干預混液的方式，將所有的試劑包含在一個凍干微球中，制備過程簡單，凍干微球中試劑的穩定性好。

本發明的第三目的在于提供一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測試劑盒，該試劑盒利用上述凍干微球，能夠簡單、快速、高效的檢測出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌存在與否，進而判斷出檢測樣本中是否含有米酵菌酸毒素，特異性強，不易出現假陽性。

本發明的第四目的在于提供一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測方法，該檢測方法僅需將上述凍干微球復溶后與模板DNA混合擴增，即可完成檢測，方法簡便，特異性強，能夠有效避免傳統檢測過程中加樣的繁瑣過程以及加樣過程中導致試劑污染、假陽性等結果。

本發明通過以下技術方案實現：