[發(fā)明專利]唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測引物組、試劑盒以及凍干微球的制備方法

在審

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• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114525324A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許世偉;許遠(yuǎn);邵俊影;吳鎮(zhèn)宇;王欣;林圣博
• 申請（專利權(quán)）人: 河南冠宇儀器有限公司;河南中檢食安生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;F26B5/06
• 代理公司: 成都頂峰專利事務(wù)所(普通合伙) 51224
• 代理人: 錢學(xué)宇

1.一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物組針對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的16S～23S rRNA保守序列設(shè)計，所述檢測引物組包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述環(huán)引物L(fēng)F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述環(huán)引物L(fēng)B的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測引物組，其特征在于，所述外引物F3和所述外引物B3的濃度均為0.15～0.25μM，所述內(nèi)引物FIP與所述內(nèi)引物BIP的濃度均為1.5～1.7μM，所述環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B的濃度為0.4～0.8μM。

3.一種用于檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的凍干微球的制備方法，其特征在于，其包括：

將如權(quán)利要求1或2所述的檢測引物組與LAMP反應(yīng)基液混合，得到擴增反應(yīng)體系；

將所述擴增反應(yīng)體系與凍干保護劑混合，逐滴滴入液氮中，控制每個液滴的體積為23～28μL，速凍成球后，冷凍干燥。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的凍干微球的制備方法，其特征在于，所述冷凍干燥的步驟包括：將在液氮中形成的微球于-50～60℃下進行第一次干燥8～16h后，在20～30℃下進行二次升華干燥4-10h。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的凍干微球的制備方法，其特征在于，所述凍干保護劑包括海藻糖、PEG20000和甘氨酸中的至少一種。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的凍干微球的制備方法，其特征在于，所述凍干保護劑是通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65％～75％的海藻糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％～10％的甘氨酸以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％～30％的PEG20000按照體積比2:3:6混合所得。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的凍干微球的制備方法，其特征在于，所述LAMP反應(yīng)基液包括：DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄、顯色劑、甜菜堿、pH調(diào)節(jié)劑、ddH₂O和buffer。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的凍干微球的制備方法，其特征在于，所述顯色劑為酚紅、甲酚或中性紅。

9.一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求3～8任一項所述的制備方法制得的凍干微球。

10.一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP檢測方法，其特征在于，其利用如權(quán)利要求9所述的檢測試劑盒進行檢測，包括：

將所述凍干微球復(fù)溶后，形成LAMP反應(yīng)體系；

將來自待測樣品中的模板DNA與所述LAMP反應(yīng)體系混合，于60～65℃下反應(yīng)50～70min，進行LAMP擴增。