[發(fā)明專利]唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP雙鏈檢測探針、凍干微球及其制備方法和檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202210344648.5 | 申請日： | 2022-03-31 |
| 公開（公告）號： | CN114703304A | 公開（公告）日： | 2022-07-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 許世偉;許遠;邵俊影;吳鎮(zhèn)宇;王欣;林圣博 | 申請（專利權(quán)）人： | 河南冠宇儀器有限公司;河南中檢食安生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01 |
| 代理公司： | 成都頂峰專利事務(wù)所(普通合伙) 51224 | 代理人： | 錢學宇 |
| 地址： | 450000 河南省鄭*** | 國省代碼： | 河南;41 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 唐菖蒲 霍爾 德氏菌 lamp 檢測 探針 凍干微球 及其 制備 方法 | ||
本發(fā)明提供一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP雙鏈檢測探針、凍干微球及其制備方法和檢測方法，屬于基因檢測領(lǐng)域。該雙鏈檢測探針包括發(fā)光探針和淬滅探針；發(fā)光探針位于FIP上，在FIP序列的5’端標記有熒光發(fā)光基團，淬滅探針與F1C的序列互補，淬滅探針的3’端標記有熒光淬滅基團。LAMP檢測凍干微球包括這種雙鏈檢測探針，該凍干微球及檢測方法，以唐菖蒲伯克霍爾德氏菌16?23sRNA為檢測靶標，采用雙鏈探針?恒溫變色體系，可兼具熒光定量PCR圖譜分析及肉眼觀察法來判讀結(jié)果，探針特異性強，變色顏色對比明顯，不易產(chǎn)生誤判，雙重體系互相映照，檢測的準確性高。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的 LAMP雙鏈檢測探針、凍干微球及其制備方法和檢測方法。
背景技術(shù)
唐菖蒲伯克霍爾德氏菌為革蘭氏陰性短桿菌、兩端鈍圓，無牙孢，有鞭毛，在自然界分布廣泛。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌為兼性厭氧，易在食品表面生長。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌可以產(chǎn)生米酵菌酸引起食物中毒，唐菖蒲伯克霍爾德氏菌不耐高溫，很容易被高溫殺死，但是它所產(chǎn)生的“米酵菌酸”毒素耐熱，一般烹調(diào)方法不能破壞其毒性。
目前常用的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢測方法包括顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法、熒光定量PCR、LAMP恒溫PCR法等，均可以有效地檢測。但顯色培養(yǎng)法存在耗時長、人為因素大等缺點，檢測一個樣本往往需要一周，還存在結(jié)果不一致性等缺陷。熒光定量PCR通量大，檢測時間短，只需要2-4小時，但需要精密昂貴的儀器及專業(yè)檢測人員，成本高，不利于推廣。LAMP環(huán)介導恒溫擴增法借助 6條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，可在等溫條件下快速，高特異性和靈敏的擴增靶序列，該方法目前因其設(shè)備簡單、檢測時間短已廣泛應(yīng)用到病原菌檢測領(lǐng)域。
環(huán)介導恒溫擴增法結(jié)果判讀方法主要有1：濁度法，可通過反應(yīng)后肉眼觀察是否存在白色絮狀沉淀，判定檢測結(jié)果，主觀因素較強，靈敏度低。2、顯色法，反應(yīng)結(jié)束后加入核酸染料SYBR GREEN、HNB、鈣黃綠素等，在紫外燈或肉眼條件下顯示不同的顏色，結(jié)果判定簡單，但需要反應(yīng)結(jié)束后開蓋，極易造成氣溶膠污染。3、熒光檢測法，該方法通過向反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR GREEN，通過熒光PCR儀可實時觀察體系中熒光變化，生成熒光曲線，通過曲線觀察擴增結(jié)果，該方法閉管檢測，杜絕氣溶膠污染，但因SYBR GREEN染料特性，能和任意的雙鏈DNA結(jié)合，并發(fā)生熒光，特異性低易出現(xiàn)假陽性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有環(huán)介導恒溫擴增法結(jié)果判讀上的缺陷，提供一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP雙鏈檢測探針、凍干微球及其制備方法和檢測方法，其針對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌16-23sRNA保守序列設(shè)計引物組和雙鏈檢測探針，能夠快速、高效的檢測出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌存在與否，靈敏度高，特異性強，且不易出現(xiàn)假陽性。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
第一方面，本發(fā)明提供一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP雙鏈檢測探針，其特征在于，雙鏈檢測探針包括發(fā)光探針和淬滅探針；
發(fā)光探針位于內(nèi)引物FIP上，在所述內(nèi)引物FIP序列的5’端標記有熒光發(fā)光基團，所述內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
淬滅探針與內(nèi)引物FIP的5’端前20個序列互補，所述淬滅探針的3’端標記有熒光淬滅基團，淬滅探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，上述熒光發(fā)光基團包括FAM、VIC、 TET；
熒光淬滅基團包括TAMRA、QSY、BHQ。
第二方面，本發(fā)明提供一種用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP檢測的凍干微球，凍干微球中含有如權(quán)利要求1或2的LAMP雙鏈檢測探針。
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