[發(fā)明專利]唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP雙鏈檢測探針、凍干微球及其制備方法和檢測方法

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• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114703304A
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許世偉;許遠(yuǎn);邵俊影;吳鎮(zhèn)宇;王欣;林圣博
• 申請（專利權(quán)）人: 河南冠宇儀器有限公司;河南中檢食安生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 成都頂峰專利事務(wù)所(普通合伙) 51224
• 代理人: 錢學(xué)宇

1.一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP雙鏈檢測探針，其特征在于，所述雙鏈檢測探針包括發(fā)光探針和淬滅探針；

發(fā)光探針位于內(nèi)引物FIP上，在所述內(nèi)引物FIP序列的5’端標(biāo)記有熒光發(fā)光基團(tuán)，所述內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

淬滅探針與所述內(nèi)引物FIP的5’端前20個(gè)序列互補(bǔ)，所述淬滅探針的3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，淬滅探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP雙鏈檢測探針，其特征在于，所述熒光發(fā)光基團(tuán)包括FAM、VIC、TET；

所述熒光淬滅基團(tuán)包括TAMRA、QSY、BHQ。

3.一種用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP檢測的凍干微球，其特征在于，所述凍干微球中含有如權(quán)利要求1或2所述的LAMP雙鏈檢測探針。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP檢測的凍干微球，其特征在于，所述凍干微球還包括檢測引物組，所述檢測引物組針對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌16S～23S rRNA基因區(qū)間保守序列設(shè)計(jì)，所述檢測引物組包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP檢測的凍干微球，其特征在于，所述雙鏈檢測探針中所述發(fā)光探針和淬滅探針的濃度比為1:1.2～1.8。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP檢測的凍干微球，其特征在于，所述外引物F3和外引物B3的濃度均為0.15～0.25μM，所述內(nèi)引物FIP和所述內(nèi)引物BIP的濃度均為1.5～1.7μM。

7.一種用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP檢測的凍干微球的制備方法，其特征在于，其包括：

將如權(quán)利要求1或2所述的LAMP雙鏈檢測探針、檢測引物組與LAMP反應(yīng)基液混合，得到擴(kuò)增反應(yīng)體系；

將所述擴(kuò)增反應(yīng)體系與凍干保護(hù)劑混合，逐滴滴入液氮中，控制每個(gè)液滴的體積為23～26μL，速凍成球后，冷凍干燥；

其中，所述檢測引物組包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP；

所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP檢測的凍干微球的制備方法，其特征在于，所述LAMP反應(yīng)基液包括：BST聚合酶、dNTPs、MgSO₄、顯色劑、甜菜堿、pH調(diào)節(jié)劑、ddH₂O和buffer。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌LAMP檢測的凍干微球的制備方法，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系與所述凍干保護(hù)劑的體積比為14～16:8；

所述凍干保護(hù)劑包括海藻糖、PEG20000和甘氨酸中的至少一種。

10.一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的LAMP雙鏈檢測方法，其特征在于，其包括：

將如權(quán)利要求3～6任一項(xiàng)所述的凍干微球加水復(fù)溶后，形成LAMP反應(yīng)體系；

將來自待測樣品中的模板DNA與所述LAMP反應(yīng)體系混合，于60～65℃下反應(yīng)50～70min，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。