[發(fā)明專利]一種黃酮醇3-O-半乳糖苷生物合成相關(guān)的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210340158.8
• 申請(qǐng)日: 2022-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115109762B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李鮮;郭妍;曹運(yùn)琳;任傳宏;解林峰;張波;陳昆松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/60;C12R1/19
• 代理公司: 杭州堅(jiān)果知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 33366
• 代理人: 劉曉

本發(fā)明提供了一種半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、表達(dá)載體和以及含有該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。本發(fā)明首次克隆并驗(yàn)證了桃黃酮醇3?O?半乳糖苷生物合成相關(guān)的PpUGT78A2基因的功能，實(shí)現(xiàn)了PpUGT78A2基因的異源活性表達(dá)，重組蛋白可以利用黃酮醇和UDP?半乳糖，高效轉(zhuǎn)化成黃酮醇3?O?半乳糖苷。本發(fā)明還提供了PpUGT78A2基因及其編碼蛋白、含有該P(yáng)pUGT78A2核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌在黃酮醇3?O?半乳糖苷生物合成中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了表達(dá)載體及含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌在黃酮醇3?O?半乳糖苷生物合成和代謝工程中的用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及重組蛋白和基因工程，具體涉及一種黃酮醇3-O-半乳糖苷生物合成相關(guān)的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

桃(Prunus?persica)原產(chǎn)中國(guó)，歷史悠遠(yuǎn)，后隨著絲綢之路和航海技術(shù)的發(fā)展，桃被傳播到世界各地。因其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。黃酮醇是桃中重要的次生代謝物，在植物發(fā)育和抵御各種環(huán)境脅迫(如紫外線照射)中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)有大量研究報(bào)道了黃酮醇抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病和消炎等醫(yī)藥學(xué)活性。

黃酮醇以糖苷的形式廣泛分布于植物根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中，桃中重要的黃酮醇糖苷包括槲皮素3-O-半乳糖苷和山奈酚3-O-半乳糖苷等，主要存在于桃葉中，桃花和桃果皮也有分布。黃酮醇糖苷是黃酮醇苷元糖基化修飾后的產(chǎn)物，主要由尿苷二磷酸(Uridine?diphosphate，UDP)糖基依賴的轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT)催化。糖基轉(zhuǎn)移酶將糖基供體轉(zhuǎn)移到受體分子，主要的糖基供體包括UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和UDP-鼠李糖。糖基化是許多次生代謝產(chǎn)物合成反應(yīng)的最后一步，同時(shí)可以改變黃酮醇化合物的親水性，增加其溶解度和化學(xué)穩(wěn)定性，影響其生物活性，有助于其在細(xì)胞內(nèi)和生物體內(nèi)的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)等。

糖基化的廣泛分布以及對(duì)調(diào)節(jié)植物生命活動(dòng)的重要性，使其受到了廣泛的關(guān)注。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，許多植物UGT家族成員得到報(bào)道，但得到充分功能驗(yàn)證的成員尚少。目前，多采用化學(xué)法合成黃酮醇類化合物，過(guò)程繁雜且某些反應(yīng)條件苛刻，這和現(xiàn)代綠色化學(xué)的合成理念是相互沖突的。因此鑒別出桃黃酮醇3-O-半乳糖苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)解析桃黃酮醇生物合成有重要意義。同時(shí)，對(duì)將來(lái)通過(guò)基因工程進(jìn)行農(nóng)作物的改良育種和為黃酮醇3-O-半乳糖苷工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)背景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明首次表征了桃PpUGT78A2基因在參與黃酮醇3-O-半乳糖苷生物合成基因中的獨(dú)特作用。從桃組織中成功克隆PpUGT78A2基因，即PpUGT78A2的cDNA序列(參見(jiàn)SEQ?IDNO.1所示序列)，通過(guò)PCR擴(kuò)增此DNA片段，然后將次片段連接至T-easy載體上(參見(jiàn)實(shí)施例1和實(shí)施列2)，驗(yàn)證成功后構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a(+)在原核細(xì)胞中首次表達(dá)了PpUGT78A2多肽或蛋白質(zhì)，即半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)SEQ?ID?NO.2所示序列和實(shí)施例2)。進(jìn)一步，本發(fā)明所述的PpUGT78A2半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是由所述的PpUGT78A2基因經(jīng)原核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程而來(lái)。所述的復(fù)制指的是細(xì)胞以所述PpUGT78A2基因的核苷酸為模板產(chǎn)生多個(gè)相同的基因的過(guò)程。PpUGT78A2所述的轉(zhuǎn)錄是指細(xì)胞以所述多個(gè)相同的PpUGT78A2基因的核苷酸為模板，根據(jù)核苷酸互補(bǔ)配對(duì)原則，以核糖核苷酸為原料，合成對(duì)應(yīng)的PpUGT78A2基因mRNA的過(guò)程。所述的翻譯是指，細(xì)胞進(jìn)一步以所述的PpUGT78A2基因mRNA為模板，以各種氨基酸為原料，合成出PpUGT78A2基因?qū)?yīng)得多肽或蛋白質(zhì)的過(guò)程。所述的PpUGT78A2基因的CDS序列如SEQ:NO.1所示，編碼序列全長(zhǎng)為1362個(gè)核苷酸，可編碼一個(gè)含453個(gè)氨基酸的蛋白。其氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，含有一個(gè)保守的PSPG-box結(jié)構(gòu)域，在糖基轉(zhuǎn)移酶大家族中屬于GT1家族。

本發(fā)明提供了一種半乳基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，至少含有下列1)～4)特征之一：

1)所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的核苷酸序列為SEQ:NO.1所示；