[發明專利]一種高通量篩選松材線蟲病生防細菌的方法

有效

• 申請號: 202210336016.4
• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114705662B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 牛犇;趙宇;王爽;吳迪;王傳珍;閆合;潘佳亮;張弘弢;王浩宇;王明越
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/30
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 宋南

本發明提供了一種高通量篩選松材線蟲病生防細菌的方法，涉及生物技術領域。所述方法包括將松材線蟲的蟲懸液與待測菌株的菌懸液混合培養后，用無菌水洗滌除去菌液，對所述松材線蟲蟲體染色進行生防細菌初篩；再利用樟子松幼苗進行生防細菌防病效果復篩；其中，所述初篩使用的染色溶液為亞甲基藍溶液和/或4,6?二氨基?2?苯基吲哚溶液。本發明提供了一種高通量、低成本且高準確度的篩選松材線蟲病生防細菌的方法，為松材線蟲病生防細菌的篩選與生物防治提供技術支持。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種高通量篩選松材線蟲病生防細菌的方法。

背景技術

由松材線蟲引發的松材線蟲病是一種全球性森林病害，可危害70種針葉樹，其中松屬樹種57種，非松屬樹種13種。松材線蟲病大面積的發生對松林資源、自然景觀和生態環境造成了嚴重破壞。

對于松材線蟲病的防治，傳統方法采用煙熏、焚燒、砍伐、殺蟲劑噴灑、樹干注射化學農藥等。這些方法本就會帶來巨大的經濟損失和環境負擔，同時也會增加松材線蟲的耐藥性。新型的生物防治方法，即篩選適合的生防菌生產環境友好型微生物制劑是控制松樹枯萎病的最佳方法之一。

現有技術中，已報道的松材線蟲病生防菌的篩選方法，主要為將細菌與松材線蟲共培養，通過松材線蟲的形態與行動狀況判斷線蟲死活，從而確定該細菌是否具有殺松材線蟲的能力。然而，這種方法存在以下缺陷：首先，對于松材線蟲死亡情況的判斷不夠精確，有些僵直不運動的線蟲實際上并未死亡，常導致假陽性的細菌被篩選出來；第二，該方法通量低，每個樣品均需要在體式顯微鏡下，人眼觀察，浪費精力；第三，該方法篩選出來的細菌，往往得不到很好的實際應用效果，因為松材線蟲病的防治，需要從松樹、線蟲、細菌三方面的共同作用著手，僅僅關注細菌致死松材線蟲的能力過于片面。此外，已經報道的松材線蟲病防治的溫室實驗多采用3年或者10年生的松樹苗，1到3個月才能顯示生防效果，實驗周期極長，要花費大量的人力物力，對溫室空間和環境也有較高要求，致使松材線蟲生防菌篩選效極率低。

因此，有必要提供一種新的篩選防治松材線蟲病細菌的方法，尤其是高效準確且高通量的篩選方法。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種篩選松材線蟲病生防細菌的方法，本發明的方法通量高、成本低且準確度高，為松材線蟲病生防細菌的篩選與生物防治提供了技術支持。

本發明提供的技術方案如下：

本發明提供了一種高通量篩選松材線蟲病生防細菌的方法，包括將松材線蟲的蟲懸液與待測菌株的菌懸液混合培養后，用無菌水洗滌除去菌液，對所述松材線蟲蟲體染色進行生防細菌初篩，再利用樟子松幼苗進行生防細菌防病效果復篩；其中，所述初篩使用的染色溶液為亞甲基藍溶液和/或4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液。

在松材線蟲病生防細菌的篩選過程中，將松材線蟲的蟲懸液與待測菌株的菌懸液混合培養一段時間后，具有松材線蟲病生防功能的細菌將表現出對松材線蟲毒殺造成松材線蟲死亡的效果。本發明通過使用亞甲基藍溶液和/或4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液進行染色，以更加清晰準確的方式來判斷線蟲死亡的情況，能夠顯著降低現有技術方法中，在體式鏡下人工肉眼觀察結果時產生的統計誤差(例如將僵直不運動的線蟲或者僅僅麻痹的線蟲統計為死亡)。

此外，本發明也同時結合生防細菌防病效果復篩，對篩選出來的細菌的應用效果進行了篩選和驗證，也就是通過評估松樹、線蟲、細菌三者在實際情況下相互作用的效果，篩選松材線蟲病的生防細菌，篩選效率更高，篩選結果能夠更準確的評價所測細菌的松材線蟲病生防作用。

在一個實施方案中，所述初篩包括使用亞甲基藍溶液進行第一次初篩實驗后，將篩選出的菌株與所述松材線蟲再次進行共培養，然后使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液進行第二次初篩實驗。