[發明專利]一種高通量篩選松材線蟲病生防細菌的方法

有效

• 申請號: 202210336016.4
• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114705662B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 牛犇;趙宇;王爽;吳迪;王傳珍;閆合;潘佳亮;張弘弢;王浩宇;王明越
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/30
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 宋南

1.一種高通量篩選松材線蟲病生防細菌的方法，其特征在于，包括將松材線蟲的蟲懸液與待測菌株的菌懸液在96孔板混合培養24小時后，用無菌水洗滌除去菌液，對松材線蟲蟲體染色進行生防細菌初篩，再利用樟子松幼苗于9天內完成生防細菌防病效果復篩；其中，所述初篩包括使用亞甲基藍溶液進行第一次初篩實驗后，將篩選出的菌株與所述松材線蟲再次進行共培養，然后使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液進行第二次初篩實驗；

當使用所述亞甲基藍溶液進行染色后，使用掃描儀成像，將圖像灰度化處理后，計算死亡率和校正死亡率；當使用所述4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液染色后，使用熒光顯微鏡成像，根據熒光強度，計算死亡率和校正死亡率；

所述初篩中設置陽性對照組、陰性對照組和校正對照組；其中，所述陽性對照組加入的菌懸液為短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)YLT40，陰性對照組加入的菌懸液為多粘類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)M-1，校正對照組用無菌水代替菌懸液；

所述生防細菌防病效果復篩包括采用1月齡的樟子松幼苗，噴淋待測菌液并注射松材線蟲懸浮液，根據所述幼苗病情指數確定所述生防細菌的防松材線蟲病效果。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述亞甲基藍溶液的終濃度為0.15～0.25mg/mL；所述4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液的終濃度為4～6μg/mL。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述亞甲基藍溶液的終濃度為0.2mg/mL；所述4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液的終濃度為5μg/mL。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述松材線蟲的蟲懸液與待測菌株的菌懸液混合培養的條件為：25℃培養18～24小時。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述松材線蟲的蟲懸液的濃度為40～50頭松材線蟲/20μL；所述待測菌株的菌懸液的活菌數為10¹²CFU/mL。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述松材線蟲的蟲懸液與所述待測菌株的菌懸液的添加體積比為1:1.8～2.5。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述松材線蟲的蟲懸液與所述待測菌株的菌懸液的添加體積比為1:2。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，當使用所述亞甲基藍溶液進行染色，染色的條件為25℃黑暗下染色3.5～4.5小時；當使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液進行染色，染色的條件為25℃黑暗下染色0.5～2小時。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，當使用所述亞甲基藍溶液進行染色，染色的條件為25℃黑暗下染色4小時；

當使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚溶液進行染色，染色的條件為25℃黑暗下染色1小時。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，染色后，用無菌水進行洗滌以除去菌液和染料。

11.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生防細菌防病效果復篩還包括在傷口處注射無菌水作為空白對照以及在傷口處注射松材線蟲懸浮液作為陰性對照。

12.一種防治松材線蟲病的方法，其特征在于，使用權利要求1～11中任一項所述的方法篩選得到的所述生防細菌進行防治。