[發明專利]敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌對南方根結線蟲致死效果的應用

有效

• 申請號: 202210328437.2
• 申請日: 2022-03-30
• 公開（公告）號: CN114703202B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 姬紅麗;謝家廉;楊芳;徐幸;于文娟
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N1/15;C12Q1/686;C12Q1/06;C12Q1/04;A01K67/033;C12R1/79
• 代理公司: 成都欣圣知識產權代理有限公司 51292
• 代理人: 王海文

1.敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌對南方根結線蟲致死效果的應用，其特征在于，在淡紫紫孢菌轉錄組和基因組測序數據中篩選得到與稻瘟病跨膜蛋白編碼基因同源的Pth11-rg1基因，所述Pth11-rg1基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示；

包括以下步驟：

S1.?制備淡紫紫孢菌原生質體；

S2.?以所述淡紫紫孢菌Pth11-rg1基因的cDNA序列為模板，分別擴增并制備Prg-L?+NP與PT?+?Prg-R片段；

S3.?混合步驟S1制備的淡紫紫孢菌原生質體和步驟S2制備的Prg-L?+?NP與PT?+?Prg-R片段，采用PEG介導淡紫紫孢菌原生質體轉化，并在含G418抗生素的T-TOP培養基中培養3-4d，獲得ΔPth11-rg1基因工程菌株；

S4.?鑒定步驟S3所獲得的ΔPth11-rg1基因工程菌株對南方根結線蟲致死效果的處理能力。

2.根據權利要求1所述的敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌對南方根結線蟲致死效果的應用，其特征在于，步驟S1具體包括：

S11.?收集所述淡紫紫孢菌分生孢子，并將孢子液濃度調整至1×10⁵CFU/mL；

S12.?以體積份數比1:1000將步驟S11所得孢子液接種于TG培養基中，28℃、150rpm搖培24-36h后，收集菌絲；

S13.?用濃度為0.7M的NaCl溶液制備蝸牛酶濃度為1mg/mL、裂解酶濃度為10mg/mL的酶解液；

S14.?向步驟S12所得菌絲中加入步驟S13制備的酶解液，30℃、150rpm裂解4-5h，過濾得濾液；

S15.?4000rpm離心處理步驟S14所得濾液，棄上清后加入STC溶液重懸得沉淀，所述沉淀為淡紫紫孢菌原生質體；

其中，

步驟S15后，可采用STC溶液調整所述淡紫紫孢菌原生質體濃度為1×10⁸個/mL，以體積份數比93：7向淡紫紫孢菌原生質體液相體系中加入DMSO混勻，以冷凍管定容100μL分裝，-80℃保存。

3.根據權利要求1所述的敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌對南方根結線蟲致死效果的應用，其特征在于，步驟S2具體包括：

S21.?通過PCR分別擴增Prg-L、Prg-R、NP、PT片段，并使Prg-L的3’端與NP的5’端存在20bp重復序列、Prg-R的5’端與PT的3’端存在20?bp重復序列；

S22.?通過融合PCR分別將步驟S21中所述Prg-L與所述NP、所述Prg-R與所述PT進行融合，形成Prg-L?+?NP與PT?+?Prg-R片段。

4.根據權利要求3所述的敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌對南方根結線蟲致死效果的應用，其特征在于，PCR引物包括：

PT-F：5’-CTTTGCTACATCCATACTCCATCCT-3’；

NP-R：5’-AGAAGGCACTCTTTGCTGCTTGGAC-3’；

形成的Prg-L?+?NP與PT?+?Prg-R片段分別為：

Pth11-rg1L-NP-F：

5’-TCGGCATATTCACCGGCATCTCTGGCATGCGGAGAGACGGACG-3’；

PT-Pth11-rg1R-R：

5’-TGAGAAACATGACTCCCGCCCTGTGCATTCTGGGTAAACGACT-3’。