[發(fā)明專利]一種同時檢測血清樣本中氧化三甲胺類物質(zhì)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210321729.3
• 申請日: 2022-03-30
• 公開（公告）號: CN115047087A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發(fā)明（設計）人: 麗麗;陳宇;唐堂
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢邁特維爾生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 北京中知星原知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11868
• 代理人: 馬如

本發(fā)明提供一種氧化三甲胺的提取、分離和鑒定方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對血清樣本中氧化三甲胺進行快速提取、準確分離并通過質(zhì)譜鑒定。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及血清中代謝物質(zhì)的檢測，屬于生物檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

TMAO是由腸道微生物利用富含膽堿或三甲胺(TMA)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)代謝生成氧化三甲胺(TMAO)，在心血管疾病如冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓等的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

心血管疾病目前是中國城鄉(xiāng)居民死亡原因的首位，高于腫瘤和其他疾病。最新發(fā)布的《中國心血管病報告2018》數(shù)據(jù)表明：中國心血管病患病率及死亡率仍處于持續(xù)上升階段，推算全國有心血管病患者2.9億，其中腦卒中1300萬，冠心病1100萬，肺心病500萬，心力衰竭45萬，風心病250萬，高血壓2.7億，心血管疾病是人類健康的主要殺手，我國心血管病防治工作已取得初步成效但仍面臨嚴峻挑戰(zhàn)，心血管疾病負擔日漸加重,已成為重大的公共衛(wèi)生問題,防治心血管疾病刻不容緩。如何早期預防和治療心血管疾病,尋找藥物作用的有效靶點,開辟新的治療途徑,成為大家關(guān)注的熱點。

代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學之后興起的又一新的組學研究分支，代謝組學通過測量細胞、組織和機體代謝產(chǎn)物的濃度變化來反映基因、蛋白質(zhì)和代謝活性本身的直接關(guān)系。由于代謝組學變化是機體對基因、疾病、環(huán)境和藥物等作用的最終反映，其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物是機體一系列生命事件的關(guān)鍵或終點反應，因此代謝組學可以幫助人們更好地了解生物體中各種復雜的相互作用及其本質(zhì)，可用于人類疾病的診斷。高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)是代謝組學研究中應用最廣泛的技術(shù)平臺之一，具有高靈敏度、高通量、線性范圍寬等特點。

人類腸道菌群是一個復雜的群落，腸道微生物群在免疫和防御、消化和代謝、炎癥和細胞增殖中起到重要作用。來自紅肉、雞蛋、乳制品、咸水魚的主要營養(yǎng)素膽堿、甜菜堿和肉堿，參與人體內(nèi)的能量代謝等生物活動。攝入后，腸道微生物對這些營養(yǎng)素的發(fā)酵會導致三甲胺(TMA)的釋放，通過宿主肝酶，含黃素的單加氧酶3(FMO3)轉(zhuǎn)化為氧化三甲胺(TMAO)。越來越多的證據(jù)表明：腸道微生物代謝小分子之一的TMAO參與膽固醇代謝、促進血小板高聚集增加血栓的形成、促進血管炎癥反應導致動脈斑塊形成。但目前尚無心血管疾病(特別是心力衰竭)診斷相關(guān)的代謝標志物。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)越來越廣泛應用于藥物、食品、環(huán)境、法醫(yī)、臨床等各個領(lǐng)域。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜中，液相色譜負責分離待測物與干擾物，質(zhì)譜負責檢測。樣品進樣后首先在流動相的攜帶下進入色譜柱，經(jīng)過色譜柱分離后，進入質(zhì)譜進行檢測。質(zhì)譜根據(jù)被測物的質(zhì)荷比(m/z)進行檢測，被測物在離子源轉(zhuǎn)換成氣相離子進入質(zhì)譜，在三重四級桿中一級質(zhì)譜掃描特定范圍離子或允許特定離子進入碰撞室，在碰撞室內(nèi)分子離子碰撞裂解，形成子離子進入二級質(zhì)譜，二級質(zhì)譜掃描特定范圍離子或允許特定離子進入檢測器。LC-MS/MS具有靈敏度高，選擇性強，準確性好等特點，在臨床檢測上適用范圍遠遠超過放射性免疫檢測和化學檢測范圍，是其他方法無可比擬的。目前現(xiàn)有技術(shù)中還并沒有針對血清樣本中氧化三甲胺的定量和定性檢測方法，本申請的目的是為了克服上述缺陷進行的技術(shù)探索。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種檢測樣本中氧化三甲胺的方法；所述的方法是利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的方法檢測血清樣本中的氧化三甲胺。在一個具體的實施例中，所述的方法包括：

1)血清樣本中氧化三甲胺的提取；

2)設置LC-MS/MS的參數(shù)條件；

3)數(shù)據(jù)處理：根據(jù)氧化三甲胺保留時間和離子對信息，對每種物質(zhì)在樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進行校正，樣本質(zhì)控分析以及獲得標準曲線。

在一個具體的實施例中，所述的樣本提取方法為：取血清樣本，按照樣本：溶劑為1:5的體積比加入70％的甲醇，混合，吸取上述混合后溶液的1/2到離心管中，-20℃靜置后，低溫離心，取上清過96孔蛋白沉淀板，備用。