[發明專利]一種酶解透明質酸寡糖混合物的檢測方法

在審

• 申請號: 202210318062.1
• 申請日: 2022-03-29
• 公開（公告）號: CN114609296A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 戴躍鋒;陳冰瑤;宋保平;畢延凱;秦立春;易磊;魏長浩
• 申請（專利權）人: 水羊化妝品制造有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 王歡

本發明提供了一種酶解透明質酸寡糖混合物的檢測方法，包括以下步驟：將酶解透明質酸寡糖液體樣品滅活，離心去除大分子，取濾過液，稀釋后作為待測液；將所述待測液采用高效液相色譜法進行分離檢測；所述高效液相色譜法色譜條件為：色譜柱為C 18柱；流動相A為乙腈；流動相B為四丁基氫氧化銨?磷酸混合水溶液；四丁基氫氧化銨?磷酸的摩爾比為(5～25):(4～20)，梯度洗脫。本發明采用高效液相色譜法，選用乙腈為流動相A，四丁基氫氧化銨?磷酸混合水溶液為流動相B進行梯度洗脫。該方法能夠針對不同酶解機制的透明質酸寡糖混合物進行分離檢測，分離度高，重復性好。

技術領域

本發明屬于液相色譜檢測技術領域，尤其涉及一種酶解透明質酸寡糖混合物的檢測方法。

背景技術

透明質酸(hyaluronan，HA)又稱玻尿酸(Hyaluronic acid)，廣泛存在于動物組織、細胞間質中，是由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸雙糖(GlcUA)單位通過β-1,4糖苷鍵連接，并以β-1,3糖苷鍵連接形成的無支鏈雙糖重復單元的黏性多糖。透明質酸廣泛應用于食品、化妝品、醫藥、保健品等領域。透明質酸寡糖(o-HAs)是指由HA降解形成，相對分子質量小于10k的寡聚糖。o-HAs的制備方式有多種，其中酶切法因為專一高效、條件溫和、易控制和產物相對單一的特點而被廣泛使用，酶切法由于水解機制的不同可以分為三類：

專利CN113801904A及專利CN113876623A均報道了一種透明質酸寡糖分布的液相檢測方法，該專利的檢測方法為：色譜柱：SUPERDEX 200 10/300GL；柱溫：40℃；檢測器：紫外-可見分光檢測器；流動相：1mol/L硫酸銨溶液；進樣濃度：0.5％；進樣量：20μL；流速：2ml/min；檢測波長：200nm。從其結果可知，透明質酸寡糖沒有完全分離，分離度不夠，且專利中的色譜柱為非常規色譜柱，成本較高。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種酶解透明質酸寡糖混合物的檢測方法，該方法分離度較高、重復性好。

本發明提供了一種酶解透明質酸寡糖混合物的檢測方法，包括以下步驟：

將酶解透明質酸寡糖液體樣品滅活，離心去除大分子，取濾過液，稀釋后作為待測液；

將所述待測液采用高效液相色譜法進行分離檢測；

所述高效液相色譜法色譜條件為：色譜柱為C18柱；流動相A為乙腈；流動相B為四丁基氫氧化銨-磷酸混合水溶液；四丁基氫氧化銨-磷酸的摩爾比為(5～25):(4～20)，梯度洗脫。

在本發明中，所述流動相B四丁基氫氧化銨-磷酸混合水溶液中四丁基氫氧化銨的濃度為10mmol/L、磷酸的濃度為8mmol/L。

在本發明中，所述四丁基氫氧化銨-磷酸混合水溶液的pH值為6.0～7.5，優選為7.00±0.02。

在本發明中，采用agilent Poroshell120EC-C18色譜柱(3.0×150mm，2.7μm)，柱溫為30℃；平衡時間為28～32h，優選為24h。

在本發明中，流動相A和流動相B的體積比為(25～50):(75～50)，優選為50:50；

流動相的流速為0.5mL/min；

檢測波長為雙波長，分別為210nm和232nm；

進樣量為5μL。

在本發明中，所述酶解透明質酸寡糖液體樣品選自牛睪丸型BTH酶酶解透明質酸寡糖液體、水蛭型LHase酶酶解透明質酸寡糖液體、細菌型MHase酶酶解透明質酸寡糖液體、高溫加熱的透明質酸寡糖水解液、或微生物滋生后透明質酸寡糖液體。