[發明專利]一種高效分離純化NKT細胞的免疫學方法

在審

• 申請號: 202210317128.5
• 申請日: 2022-03-28
• 公開（公告）號: CN114561353A
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 鄒瑤;王婷婷;于超
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種高效分離純化NKT細胞的方法，涉及免疫學、分子生物學、分子免疫學等技術領域。所述分離純化的方法包括：1)T細胞的分選；2)NKT細胞的分選；3)NKT細胞的純度鑒定的驗證；4)分選中脾臟細胞數目的選擇；本發明得到了高純度的NKT細胞，為NKT細胞在心血管、腫瘤、自身免疫疾病的細胞免疫治療方面具有極為深遠的意義。

技術領域

本發明涉及免疫學、分子生物學、分子免疫學等多項領域。具體包括T細胞的分選、NKT細胞的分選、NKT細胞的純度鑒定。

背景技術

自然殺傷T細胞(natural killer T cells，NKT)作為一類特殊的T細胞亞群，在固有和獲得性免疫中均發生著重要作用。在小鼠體內，NKT細胞被定義為 CD3+NK1.1+NKT；在人體中NKT細胞被定義為CD3+CD56+NKT。NKT細胞既表達T細胞受體(TCR)，又表達NK細胞受體。NKT細胞既可以促進細胞介導的抗腫瘤、抗感染作用，又可以通過調節免疫耐受防止自身免疫性疾病的發生。作為先天免疫和適應性免疫的橋梁，NKT細胞在很多病理條件下發揮作用。目前NKT細胞發揮其作用主要依靠3種途徑：1.經抗原激活后，NKT細胞可通過自身分泌細胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-10等發揮效應；2.NKT細胞被激活后，可釋放穿孔素、顆粒酶；3.激活的NKT細胞，釋放的相關細胞因子會激活鄰近的NK細胞、B細胞和抗原提呈細胞。當NKT細胞被激活后，大量表達多種細胞因子，包括IFNγ，IL-15，IL-18和TNFα等促炎癥因子以及IL-4,IL-10和IL-13 等抗炎癥因子。這些細胞因子一方面能夠直接作用于NKT細胞，發揮細胞毒性作用，另一方面夠反式激活其他免疫細胞，如自然殺傷T細胞、B細胞等，發揮免疫調節作用。因此現多認為NKT細胞能夠介導保護性和調節性免疫功能，在腫瘤、感染以及自身免疫疾病中發揮調節作用。

現如今，細胞免疫治療法蓬勃發展。作為一種新興的生物治療方法，細胞免疫治療法是指通過過繼輸注體外誘導擴增的自體細胞，可以有效的調控機體免疫平衡，恢復機體免疫系統的功能紊亂。細胞國際轉移治療為免疫細胞系統失衡所導致的多種疾病，如腫瘤、自身免疫性疾病及心血管疾病的治療提供了非常重要的研究思路。因此，獲取特定的具有功能的免疫細胞用于細胞免疫治療的研究具有重要作用。

CD3⁺CD56⁺NKT細胞作為一類新的細胞毒性效應細胞兼有T淋巴細胞強大的免疫活性和NK細胞的非MHC限制性廣譜免疫作用，且對骨髓造血系統影響小的優點，是目前血液系統腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病過繼性免疫治療中常用的細胞，被認為是過繼性細胞免疫治療的首選方法。但目前NKT細胞的分離提純仍存在較大的難度。

因此，發明一種高效分離純化NKT的方法，對自身免疫性疾病、腫瘤以及心血管疾病的治療具有及其重要的意義。

發明內容

本發明提供了一種高效分離純化NKT細胞的方法，其具體步驟包括：

1.小鼠脾臟中T細胞的分離純化：

1)C57小鼠脾臟中T細胞的分離純化

(1)C57小鼠用水合氯醛麻醉后處死，置于75％乙醇中浸泡數分鐘。

(2)解剖小鼠，取出脾臟，將脾臟置于鋼網上，加入PBS溶液，研磨。

(3)研磨后，收集脾臟細胞懸液于15mL離心管中。

(4)在室溫條件下，1500-1800rpm，5min進行離心操作。

(5)離心完畢后，棄去上清，加入3mL紅細胞裂解液，重懸。

(6)裂解5分鐘后，1500-1800rpm，5min進行離心操作。

(7)離心完畢后，棄去上清，再次加入3mL紅細胞裂解液，重懸。