[發明專利]高產羅克霉素的基因工程菌及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202210315688.7
• 申請日: 2022-03-29
• 公開（公告）號: CN114806986A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 徐琳;王小花;羅楚平;夏雪芹;陸晨曦;吳靜雨;楊雪婷;羅科程;孫恬晉;趙頤;覃雨婷;張金峰;田寶霞
• 申請（專利權）人: 淮陰工學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P21/02;C07K7/06;A61K35/742;A61K38/08;A61P31/20;C12R1/125
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開了高產羅克霉素的基因工程菌及其構建方法和應用，該基因工程菌以枯草芽孢桿菌Bs916為出發菌株，敲除或者失活菌株基因組中負調控SpoⅢD和/或Spo0AⅡ基因所得。本發明的基因工程菌株發酵生產羅克霉素的產量是菌株Bs916的13.8倍，在5L發酵罐40?50h可穩定生產羅克霉素，產量達到45?50mg/L，該羅克霉素高產基因工程菌及其構建方法為加速羅克霉素的產業化提供原材料，同時高產羅克霉素的基因工程菌可用于制備克氏原螯蝦WSSV的防治生物試劑。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高產羅克霉素的基因工程菌及其構建方法和應用。

背景技術

枯草芽孢桿菌是飼料添加劑使用芽孢桿菌之一，其最大的優勢是其產生的芽孢不僅耐熱、而且抗逆，因此在自然界廣泛分布。它可以產生多種抗菌物質，脂肽類抗生素是其中一種。經研究發現，生防枯草芽孢桿菌Bs916可以合成表面活性素、伊枯草素、泛革素和羅克霉素這四大脂肽類抗生素家簇，被認為是研究脂肽類抗生素的優良菌株。由于脂肽類抗生素可以廣范圍抑制細菌、對抗病毒、治療腫瘤以及調節免疫活性，在生物行業、制藥領域、農藥研發領域以及工業生產上都具有廣泛的應用價值。

羅克霉素是從生防枯草芽孢桿菌中分離出來的一組含有9個氨基酸寡肽頭部和13～15個脂肪酸碳鏈尾巴的新型環脂肽類抗生素。羅克霉素是一種極具研究價值的抗生素，具體表現在羅克霉素具有明顯的抑制細菌及病毒特性及較低的溶血性，因此在生物醫藥、工業、農業、養殖業等領域中都具有很好的應用前景。申請人前期研究顯示羅克霉素在Bs916中的產量極低，僅達到3.6mg/L，這是限制其應用的最大瓶頸。因此，進一步了解其合成調控機理，構建高產工程菌具有重要的意義。

WSSV全稱為white spot syndrome virus，即白斑綜合征目前針對該疾病并沒有有效的治療手段，養殖業中也多以預防為主，其中免疫調節劑被認為是一種環境友好型、可操作實施的手段。現有治療白斑綜合征的手段包括使用多種敏感抗生素，這可能導致嚴重的問題，如：病原菌的抗藥性、藥物在魚體中的殘留、環境污染等。與此同時，與抗生素相比，疫苗接種具有安全性、環境友好性、長期療效保護性的優勢，但是疫苗的操作性不強，使用疫苗較為繁瑣，且直接投撒進河道，疫苗失活較快，對水生動物免疫調節不起作用。

免疫調節劑是調節細胞免疫和體液免疫功能的制劑，已有研究證實中草藥提取成分、益生菌及其所產生的活性抗菌肽能夠有效應用于防治白斑綜合征。

發明內容

發明目的：針對目前對羅克霉素調控機理認識不清，且現有菌株生產羅克霉素的產量甚少，限制其廣泛的運用，本發明提供一種高產羅克霉素的基因工程菌，本發明通過對以枯草芽孢桿菌Bs916基因組中負調控基因SpoⅢD及Spo0AⅡ基因進行敲除或者缺失構建得到了全新的高產羅克霉素的基因工程菌。

本發明還提供所述高產羅克霉素的基因工程菌的構建方法與應用。

技術方案：為了實現上述目的，本發明所述一種高產羅克霉素的基因工程菌，所述基因工程菌以枯草芽孢桿菌Bs916為出發菌株，敲除或者失活菌株基因組中負調控基因SpoⅢD和/或Spo0AⅡ所得。

其中，所述負調控基因SpoⅢD，Spo0AⅡ的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

其中，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌Bs916。

本發明所述高產羅克霉素的基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)以SpoⅢD，Spo0AⅡ編碼基因為模板設計引物，以枯草芽孢桿菌Bs916的基因組DNA作為模板，擴增到部分SpoⅢD，Spo0AⅡ基因片段；

(2)同源重組質粒載體pMUTINSpoⅢD的構建：擴增的SpoⅢD基因片段經過雙酶切，然后連接到經過同樣雙酶切的質粒載體pMUTINLoc中，構建同源重組整合質粒載體pMUTINSpoⅢD；