[發(fā)明專利]高產(chǎn)羅克霉素的基因工程菌及其構建方法和應用

在審

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• 申請日: 2022-03-29
• 公開（公告）號: CN114806986A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設計）人: 徐琳;王小花;羅楚平;夏雪芹;陸晨曦;吳靜雨;楊雪婷;羅科程;孫恬晉;趙頤;覃雨婷;張金峰;田寶霞
• 申請（專利權）人: 淮陰工學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P21/02;C07K7/06;A61K35/742;A61K38/08;A61P31/20;C12R1/125
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種高產(chǎn)羅克霉素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，敲除或者失活菌株基因組中負調控基因SpoⅢD和/或Spo0AⅡ所得。

2.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)羅克霉素的基因工程菌，其特征在于，所述負調控基因SpoⅢD，Spo0AⅡ的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)羅克霉素的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌優(yōu)選為枯草芽孢桿菌Bs916。

4.一種權利要求1所述高產(chǎn)羅克霉素的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以SpoⅢD，Spo0AⅡ編碼基因為模板設計引物，以枯草芽孢桿菌Bs916的基因組DNA作為模板，擴增到部分SpoⅢD，Spo0AⅡ基因片段；

(2)同源重組質粒載體pMUTINSpoⅢD的構建：擴增的SpoⅢD基因片段經(jīng)過雙酶切，然后連接到經(jīng)過同樣雙酶切的質粒載體pMUTINLoc中，構建同源重組整合質粒載體pMUTINSpoⅢD；

(3)同源重組質粒載體pUCSCSpo0AⅡ的構建：擴增的Spo0AⅡ基因片段經(jīng)過雙酶切，然后連接到經(jīng)過同樣雙酶切的質粒載體pUCSCSrf中，構建同源重組整合質粒載體pUCSCSpo0AⅡ；

(4)SpoⅢD基因失活突變菌株ΔSpoⅢD的構建：將構建好的重組質粒pMUTINSpoⅢD轉化至枯草芽孢桿菌Bs916得到高產(chǎn)羅克霉素的SpoⅢD基因失活突變株ΔSpoⅢD；

(5)Spo0AⅡ基因失活突變菌株ΔSpo0AⅡ的構建：將構建好的重組質粒pUCSCSpo0AⅡ轉化至枯草芽孢桿菌Bs916得到高產(chǎn)羅克霉素的Spo0AⅡ基因失活突變株ΔSpo0AⅡ；

(6)SpoⅢD與Spo0AⅡ雙基因失活突變菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD的構建：將構建好的重組質粒pUCSCSpo0AⅡ轉化至枯草芽孢桿菌Bs916突變株ΔSpoⅢD中得到高產(chǎn)羅克霉素的SpoⅢD與Spo0AⅡ雙基因失活突變菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD。

5.根據(jù)權利要求4的構建方法，其特征在于，步驟(1)所述的引物為SpoⅢD-F(5’-TTTAAGCTTAAAAGAACCGGCGGAATCGT-3’)和SpoⅢD-R(5’-TTTGGATCCCTGACATTTCCGCTTACCTG-3’)用于擴增SpoⅢD基因片段；Spo0AⅡ-F(5’-TTTAAGCTTCTTTTCCCGCTTGTCTTCTC-3’)和Spo0AⅡ-R(5’-TTTGGATCCTTCTTGTACTTTAGTTTCGT-3’)用于擴增Spo0AⅡ基因片段。

6.一種權利要求1所述高產(chǎn)羅克霉素的基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)羅克霉素中的應用。

7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵為通過基因工程菌進行發(fā)酵罐發(fā)酵：將菌種活化后制備種子液，按照體積比10-20％接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，開始發(fā)酵，發(fā)酵過程中控制pH穩(wěn)定在6.8-7.2，溫度維持在35-38℃，溶氧在25-35％之間；發(fā)酵周期40-50h。

8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g/L，麥芽糖漿40-50g/L，玉米漿15-20g/L，尿素0.6-0.8g/L，K₂HPO₄ 7g/L，MgSO₄·7H₂O 0.35g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10mg/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L，pH 7.0-7.2。

9.一種權利要求1所述高產(chǎn)羅克霉素的基因工程菌在制備用于克氏原螯蝦白斑綜合征的防治生物試劑中的應用。

10.一種SpoⅢD和/或Spo0AⅡ編碼基因在調控枯草芽孢桿菌羅克霉素產(chǎn)量中的應用。