[發(fā)明專利]一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210315069.8
• 申請日: 2022-03-28
• 公開（公告）號: CN114578063A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱文娜;雷高新;彭福中;王永智;陳凌;吳宏斌;丁敏;劉波
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇華泰疫苗工程技術(shù)研究有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明屬于生物醫(yī)療檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF?α的方法，包括如下步驟：S1、樣品處理；S2、ELISA檢測。本發(fā)明只需要少量的血清樣品，便可以對疾病進(jìn)行更加便捷的檢測，其檢測方案中線性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、區(qū)間精密度等檢測結(jié)果均滿足適用血清樣本TNF?α的測定，并且操作簡單、檢測速度快、可定量檢測和大批量檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)療檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法。

背景技術(shù)

TNF-α(腫瘤壞死因子α)，是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一。

ELISA檢測原理包括向載體酶標(biāo)板孔中加入捕獲抗體，捕獲抗體包被在該載體上，形成固相抗體，保持其免疫活性；然后向酶標(biāo)板孔中加入樣品，樣品中待檢測蛋白與固相抗體特異性結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物，洗滌除去雜質(zhì)；再向酶標(biāo)板孔中加入帶有生物素的檢測抗體，檢測抗體與固相抗原復(fù)合物結(jié)合；最后向酶標(biāo)板孔中加入帶有親和素的辣根過氧化酶。再加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，有色產(chǎn)物的量與樣品中待檢測蛋白的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定量分析。

目前市面上存在許多人TNF-α的ELISA檢測試劑盒，原理基本一致，通過抗原抗體反應(yīng)聯(lián)合TMB顯色來檢測TNF-α。但這些試劑盒在TNF-α存在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度偏低，無細(xì)胞共培養(yǎng)材料、使用不便等不足之處。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子 TNF-α的方法。

本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法，包括如下步驟：

S1、樣品處理：

血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)；

S2、ELISA檢測：

S21、標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50ul；

S22、加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔，在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中加樣品50ul；

S23、加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100ul，空白孔除外；

S24、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘；

S25、配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；

S26、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔洗滌液(250ul左右)，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；

S27、顯色：每孔先加入顯色劑A 50ul，再加入顯色劑B 50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；

S28、終止：每孔加終止液50ul，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)；

S29、測定：450nm波長依序測量各孔的吸光度OD值；

S210、計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

優(yōu)選地，所述S1樣品處理步驟中，收集的上清保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

優(yōu)選地，所述S22加樣步驟中，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。