[發明專利]一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法

在審

• 申請號: 202210315069.8
• 申請日: 2022-03-28
• 公開（公告）號: CN114578063A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 邱文娜;雷高新;彭福中;王永智;陳凌;吳宏斌;丁敏;劉波
• 申請（專利權）人: 江蘇華泰疫苗工程技術研究有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、樣品處理：

血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)；

S2、ELISA檢測：

S21、標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50ul；

S22、加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔，在酶標包被板上待測樣品孔中加樣品50ul；

S23、加酶：每孔加入酶標試劑100ul，空白孔除外；

S24、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘；

S25、配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；

S26、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔洗滌液(250ul左右)，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干；

S27、顯色：每孔先加入顯色劑A 50ul，再加入顯色劑B 50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；

S28、終止：每孔加終止液50ul，終止反應(此時藍色立轉黃色)；

S29、測定：450nm波長依序測量各孔的吸光度OD值；

S210、計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線，計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

2.根據權利要求1所述的一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法，其特征在于，所述S1樣品處理步驟中，收集的上清保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

3.根據權利要求1所述的一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法，其特征在于，所述S22加樣步驟中，加樣時將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

4.根據權利要求1所述的一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法，其特征在于，所述S29測定步驟中，測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

5.根據權利要求1-4任一所述的一種ELISA法檢測人腫瘤壞死因子TNF-α的方法，其特征在于，所述S1、S2步驟完成后，具體的驗證方法分別為：

(1)線性：分別取不同濃度的標準品溶液，按照S2中方法進行檢測，分別做3個平行，記錄各孔OD值，作標準曲線，并給出標準曲線線性方程及相關系數；

(2)重復性：取來源于3個志愿者的血清，按照S2中的方法進行TNF-α檢測，各做6個平行，進行顯色后，記錄各孔OD值，代入標準曲線計算TNF-α含量及RSD值；

(3)準確度：選擇一份血清樣品，分別加入濃度為40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml的標準品溶液進行2倍稀釋制備加標樣品，按照S2中的方法進行檢測，分別做3個平行，記錄各孔OD值，根據標準曲線計算TNF-α含量，計算回收率重復三次試驗；

(4)區間精密度：由兩名不同實驗人員各自獨立操作，按照S2中的方法對來源于3個志愿者的血清進行檢測，分別做6個平行，酶標儀讀取OD值后，計算樣品濃度，求出平均值，并計算所得結果含量的RSD值。