[發明專利]檢測MMACHC基因突變位點的引物探針及試劑盒

在審

• 申請號: 202210303672.4
• 申請日: 2022-03-24
• 公開（公告）號: CN114790480A
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 楊堯;張魯軍;郭翠;韋淑杯;張偉;戴國華;王慶;張燕娜;李旭卉;納洋
• 申請（專利權）人: 蘇州淦江生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供一種檢測MMACHC基因突變位點的引物探針及試劑盒，可同時檢測MMACHC基因的14個突變位點，包括c.1AG、c.81+1GA、c.217CT、c.315CG、c.365AT、c.394CT、c.445?446delTG、c.481CT、c.482GA、c.565CA、c.567dupT、c.609GA、c.626_627delTG和c.658?660delAAG。本發明高效便捷，一次檢測通過3個擴增反應體系檢測14個MMACHC突變位點。通過相鄰雙探針系統增強檢測信號，靈敏度達1ng，實現微量血樣樣本檢測多個MMACHC基因突變位點，有利于新生兒篩查檢測。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種檢測MMACHC基因突變位點的引物探針及試劑盒。

背景技術

甲基丙二酸血癥(methylmalonic acidemia，MMA)是有機酸代謝異常中最常見的疾病，是多種原因所致體內甲基丙二酸蓄積的總稱，屬于常染色體隱性遺傳，分為單純型甲基丙二酸血癥和甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥兩種類型。國內MMA主要以甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥為主，包括cb1C、cb1D及cb1F三種亞型，其中約有90％以上為cb1C型，致病基因為MMACHC，存在熱點突變位點。

甲基丙二酸血癥發病年齡各異，臨床表現常無特異性，常常被誤診為一般圍生期腦損害、敗血癥、急慢性腦病或腦變性病，常見喂養困難、嘔吐、呼吸急促、驚厥、肌張力異常、嗜睡、智力、運動落后或倒退。目前臨床主要依靠串聯質譜和氣相色譜-質譜檢測代謝標記物進行新生兒篩查和臨床診斷，質譜檢測容易收到干擾，假陽性率高，發現異常進行召回復查耽誤治療時間，基因突變檢測是確診和基因分型的可靠措施，特別是通過新生兒干血斑進行快速MMACHC熱點篩查，避免進行復查采樣，提高患者確診時間和效率。

目前對于MMCHC基因進行檢測方法主要有Sanger測序、高通量測序技術、基因芯片、飛行時間質譜技術，這些方法由于檢測步驟繁瑣、儀器昂貴、檢測通量限制等原因，臨床應用推廣受到極大限制，特別是現有方法需要較多抗凝血血液樣本進行純化DNA后進行基因檢測，在新生兒篩查中心難以從收集的有限的干血斑樣本進行快速基因檢測。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中存在的需要較多抗凝血血液樣本、前處理和檢測操作繁瑣、耗時長、檢測成本高、易污染及通量較低等缺點，提供可以檢測微量血液樣本、快速處理、簡便快捷、靈敏度高、可靠性強且成本較低的基于多色探針熔解曲線而設計的用于檢測MMACHC基因突變位點的引物探針及試劑盒。

本發明構思如下：利用相鄰淬滅雙探針進行熔解曲線分析，相鄰雙探針檢測系統由兩條探針配合使用，一條突變檢測探針標記熒光基團，配套的錨定探針標記淬滅基團，突變檢測探針和錨定探針與靶標DNA結合位置相鄰。在通過PCR擴增產生靶標產物DNA，熔解曲線過程中，兩條探針退火雜交在目標DNA序列上，熒光基團與淬滅基團靠近，熒光基團的熒光被淬滅，熒光信號低，隨著溫度升高，雜交雙鏈慢慢解鏈，熒光標記的突變檢測探針與錨定探針分離，熒光基團與淬滅基團距離變大，淬滅效果逐漸減弱，熒光信號變強，熒光信號變化速率最快的溫度就是探針檢測的熔點(Tm)值。突變檢測探針覆蓋待測的突變位點，因為突變位點的存在，突變檢測探針與靶標中的突變型位點不能完全結合，造成雙鏈結構穩定性降低，因此熔解曲線分析中Tm下降，從而實現檢測遺傳基因突變位點的功能。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種檢測MMACHC基因突變位點的引物組，所述引物組包括檢測c.1AG和c.81+1GA位點的引物對I，檢測c.217CT位點的引物對II，檢測c.315CG、c.365AT和c.394CT位點的引物對III，檢測c.445_446delTG和c.481CT、c.482GA位點的引物對IV，檢測c.565CA、c.567dupT、c.609GA、c.626_627delTG和c.658_660delAAG位點的引物對V；

引物對I包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物；