[發明專利]檢測MMACHC基因突變位點的引物探針及試劑盒

在審

• 申請號: 202210303672.4
• 申請日: 2022-03-24
• 公開（公告）號: CN114790480A
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 楊堯;張魯軍;郭翠;韋淑杯;張偉;戴國華;王慶;張燕娜;李旭卉;納洋
• 申請（專利權）人: 蘇州淦江生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

1.檢測MMACHC基因突變位點的引物組，其特征在于，所述引物組包括檢測c.1AG和c.81+1GA位點的引物對I，檢測c.217CT位點的引物對II，檢測c.315CG、c.365AT和c.394CT位點的引物對III，檢測c.445_446delTG和c.481CT、c.482GA位點的引物對IV，檢測c.565CA、c.567dupT、c.609GA、c.626_627delTG和c.658_660delAAG位點的引物對V；

引物對I包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物；

引物對II包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物；

引物對III包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物；

引物對IV包括如SEQ ID NO:7所示的上游引物和如SEQ ID NO:8所示的下游引物；

引物對V包括如SEQ ID NO:9所示的上游引物和如SEQ ID NO:10所示的下游引物。

2.與權利要求1所述引物組配套使用的探針，其特征在于，包括突變檢測探針和錨定探針；其中，突變檢測探針5’端標記熒光基團，且3’端進行C3 Spacer修飾，同時錨定探針3’端標記熒光淬滅基團；或者，突變檢測探針3’端標記熒光基團，同時錨定探針5’端標記熒光淬滅基團，且3’進行C3 Spacer修飾；

c.1AG位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:11和12所示；

c.81+1GA位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:13和14所示；

c.217CT位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:15和16所示；

c.315CG位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:17和18所示；

c.365AT位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:19和18所示；

c.394CT位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:20和21所示；

c.445_446delTG位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ IDNO:22和23所示；

c.481CT、c.482GA位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ IDNO:24和23所示；

c.565CA和c.567dupT位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQID NO:25和26所示；

c.609GA位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:27和26所示；

c.626_627delTG位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ IDNO:28和29所示；

c.658_660delAAG位點對應的突變檢測探針和錨定探針的核苷酸序列分別如SEQ IDNO:30和31所示。

3.根據權利要求2所述的探針，其特征在于，所述熒光基團選自FAM、HEX、CY5、ROX中的至少一種，所述熒光淬滅基團選自BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一種。

4.MMACHC基因突變位點檢測試劑盒，其特征在于，包括前處理液、擴增反應液和突變檢測液，所述突變檢測液選自突變檢測液A、突變檢測液B、突變檢測液C中的至少一種；

所述前處理液為：5％Chelex-100+0.2M NaOH；

所述擴增反應液為：0.5-2U熱啟動Taq酶、0.05-0.2U UNG酶、1-10nmol dNTP、1-10nmoldUTP和5ul 5×PCR緩沖液；其中，所述5×PCR緩沖液由pH 8.8的150-350mM Tris-HCl、10-20mM MgCl₂、0.5-2.5％BSA、0-15％甘露醇，20-80mM(NH₄)₂SO₄、0-0.05％Tween20和5-25％海藻糖組成，以水配制；

所述突變檢測液A為：如SEQ ID NO:1所示的引物1.5pmol、如SEQ ID NO:2所示的引物20pmol、如SEQ ID NO:7所示的引物1pmol、如SEQ ID NO:8所示的引物10pmol、如SEQ IDNO:11所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:13所示的探針7.5pmol、如SEQ ID NO:22所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:24所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:12所示的探針5pmol、如SEQ IDNO:14所示的探針7.5pmol和如SEQ ID NO:23所示的探針5pmol，以水配制；

所述突變檢測液B為：如SEQ ID NO:5所示的引物1pmol、如SEQ ID NO:6所示的引物10pmol、如SEQ ID NO:9所示的引物1pmol、如SEQ ID NO:10所示的引物0.4μM、如SEQ IDNO:17所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:19所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:20所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:28所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:18所示的探針5pmol、如SEQ IDNO:21所示的探針5pmol和如SEQ ID NO:29所示的探針5pmol，以水配制；

所述突變檢測液C為：如SEQ ID NO:3所示的引物1.5pmol、如SEQ ID NO:4所示的引物15pmol、如SEQ ID NO:9所示的引物1pmol、如SEQ ID NO:10所示的引物10pmol、如SEQ IDNO:15所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:25所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:27所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:30所示的探針5pmol、如SEQ ID NO:16所示的探針5pmol、如SEQ IDNO:26所示的探針5pmol和如SEQ ID NO:31所示的探針5pmol，以水配制。