[發(fā)明專利]基于Cardipy染料的溶酶體靶向熒光探針及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210295703.6
• 申請(qǐng)日: 2022-03-24
• 公開（公告）號(hào): CN114539268B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫遠(yuǎn)強(qiáng);孫朋娟;李朝輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C07D487/16
• 分類號(hào): C07D487/16;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41125
• 代理人: 冉珊敏

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及溶酶體靶向熒光探針的設(shè)計(jì)，特別是指基于Cardipy染料的溶酶體靶向熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。該探針結(jié)構(gòu)式如下：。熒光強(qiáng)度隨著pH降低逐漸增強(qiáng)，在pH=4?7范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與pH值呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。基于對(duì)pH的敏感性，將其應(yīng)用于溶酶體內(nèi)pH波動(dòng)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及傷口的可視化。本發(fā)明的探針具有較好水溶性、較高的光穩(wěn)定性和較深的組織滲透能力的優(yōu)點(diǎn)，可用于細(xì)胞及活體層面上的研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及溶酶體靶向熒光探針的設(shè)計(jì)，特別是指基于Cardipy染料的溶酶體靶向熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

溶酶體作為一種酸性細(xì)胞器（pH 4.5-5.5）在很多的生理過程中發(fā)揮著重要的角色。其內(nèi)部含有50多種酸性水解酶，這些水解酶在酸性條件下被激活，將細(xì)胞中的生物大分子降解為小分子，然后從溶酶體中輸出，用于生物合成的重新利用，以維持細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。除此以外，溶酶體還可以在水解酶的協(xié)助下清除受細(xì)胞內(nèi)受損傷的細(xì)胞器，蛋白質(zhì)以及核酸。然而，溶酶體內(nèi)pH的失衡會(huì)導(dǎo)致酸性水解酶的活性降低及溶酶體的功能受損，從而引起細(xì)胞內(nèi)生理過程及生命活動(dòng)的紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)貯積癥等一系列溶酶體相關(guān)疾病的產(chǎn)生。因此，開發(fā)有效的工具用來監(jiān)測(cè)溶酶體內(nèi)pH的波動(dòng)是必要的。

小分子熒光探針呈現(xiàn)出高的選擇性和靈敏性、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)以及響應(yīng)快的優(yōu)勢(shì)而被廣泛地用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境、生物分子、氨基酸等進(jìn)行傳感及成像。基于溶酶體弱酸性的特性，很多溶酶體靶向型的探針被開發(fā)。但是大多數(shù)溶酶體探針都是通過在分子結(jié)構(gòu)中引入嗎啡啉、二甲氨基、二乙胺基等弱堿性的脂肪胺基團(tuán)實(shí)現(xiàn)溶酶體的靶向性的。這些弱堿性基團(tuán)的引入會(huì)消耗溶酶體中的質(zhì)子，引起溶酶體內(nèi)部pH的升高，降低酸性水解酶的活性，導(dǎo)致溶酶體功能受損。目前，迫切需要開發(fā)新型的不依賴弱堿性胺為pH響應(yīng)位點(diǎn)的新型的溶酶體靶向熒光探針。

通過酚羥基保護(hù)與脫保護(hù)，激活型熒光探針被廣泛的應(yīng)用于生物體內(nèi)的傳感與成像。基于酚負(fù)離子具有強(qiáng)的供電子能力，能夠在熒光探針內(nèi)作為強(qiáng)供電子基團(tuán)，形成有效的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移作用，從而顯示強(qiáng)的熒光。當(dāng)以酚羥基或者被酯類等基團(tuán)保護(hù)住后，酚羥基的供電子能力較弱，不能形成有效的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移作用，從而顯示較短的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)以及弱的熒光。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活性物質(zhì)的識(shí)別傳感。但是基于酚羥基保護(hù)和脫保護(hù)類型的探針在用到溶酶體成像時(shí)存在著巨大的挑戰(zhàn)。這是因?yàn)槌Ｒ姷姆恿u基類型的探針在弱酸性條件下沒有熒光，在中性或弱堿性條件下顯示強(qiáng)的熒光，當(dāng)該類型探針進(jìn)入溶酶體后，會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅，從而無法對(duì)溶酶體進(jìn)行有效的監(jiān)測(cè)。因此，開發(fā)基于酚羥基的細(xì)胞溶酶體靶向的熒光增強(qiáng)型探針具有重大意義，也具有非常大的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種基于Cardipy染料的溶酶體靶向熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

基于Cardipy染料的溶酶體靶向熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：

。

上述的溶酶體靶向熒光探針的制備方法，技術(shù)路線如圖1所示，步驟為：

（1）將2,4-二甲基吡咯和氫氧化鉀溶解于干燥的DMSO中，在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢韬蠹尤攵燃淄樵诶^續(xù)攪拌得到白色固體即化合物2；

（2）向化合物2的甲苯溶液中加入三光氣所得混合溶液回流5 h，經(jīng)快速柱色譜分離混合物得白色固體3；

（3）將化合物3的無水THF溶液加入到鄰甲基溴苯和正丁基鋰的混合溶液中反應(yīng)，反應(yīng)溶液經(jīng)純化后得化合物4；

（4）化合物4在冰醋酸與哌啶催化下進(jìn)一步與對(duì)羥基苯甲醛反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后除去有機(jī)溶劑后將剩余的物質(zhì)溶解在HCl和THF的1:1混合物中進(jìn)行陰離子交換，所得混合溶液的有機(jī)層經(jīng)萃取、干燥蒸發(fā)、純化得到紅色固體。

優(yōu)選的，所述步驟（1）中2,4-二甲基吡咯、氫氧化鉀和二氯甲烷的物質(zhì)的量比為2:3:1.5。