[發明專利]一種莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株、構建方法及應用

在審

• 申請號: 202210293436.9
• 申請日: 2022-03-23
• 公開（公告）號: CN115011534A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 解志紅;孫麗;王丹丹;殷志秋;黃煒娓;耿全政;趙紅玲
• 申請（專利權）人: 山東農業大學;山東蓬勃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12N15/66;C05F11/08;A01N63/20;A01P21/00;C12R1/41
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 周紅英

本發明提供了一種莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株、構建方法及應用，所述突變株為AZC_0343基因缺失的莖瘤固氮根瘤菌；本發明以莖瘤固氮根瘤菌ORS571的基因組DNA為模板，分別以引物0343?up?F/R、0343?down?F/R擴增AZC_0343基因的上游片段和下游片段；將擴增產物酶切酶連構建重組質粒，然后將重組質粒導入大腸桿菌，并通過三親接合方法導入莖瘤固氮根瘤菌ORS571；最后篩選得到所述突變株。本發明所述突變株的固氮能力顯著，其固氮酶活性比野生株提升了88.56％，且所述突變株可以增加土壤養分、提高肥料有效性，促進玉米生長，具有開發成微生物接種劑或微生物菌肥的良好前景。

【技術領域】

本發明涉及農業微生物領域，具體涉及一種莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株、構建方法及應用。

【背景技術】

氮是植物生長所需的三大主要營養素之一，作物體內蛋白質、酶、核酸、葉綠素、維生素等有機化合物的合成都離不開氮的參與。氮在大氣中含量豐富(占79％左右)，但大多數植物無法直接利用氮氣。農業生產中施用氮肥增產是緩解耕地資源不足、保證糧食品質的重要措施；然而，隨著施氮量的進一步增加，農作物產量卻不再增加，并且氮效率大幅度下降。研究表明過量施氮導致玉米葉片早衰，產籽量降低；并且長期過量施用氮肥會造成土壤板結，污染環境并影響土壤微生態。因此，科學使用肥料，開發新型綠色肥料保證農田可持續生產能力，促進農業綠色發展仍然是努力的方向。

微生物肥料因具有調節植物生長、增加作物產量、改善作物品質、減少化肥使用量、改良土壤、保護生態環境等特點受到廣泛關注，成為綠色生態農業發展中不可替代的制勝法寶之一。固氮細菌與植物共生固氮的過程中將大氣中的氮氣轉化為更容易被宿主植物利用的氨。莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)屬于桿菌，是從豆科植物毛萼田菁莖瘤中分離到的固氮細菌，其細胞直徑大于2.0μm且長短不一，呈卵圓狀或類球狀，其宿主特異性很強。ORS571除了可以和宿主植物共生固氮，還能夠在微耗氧的條件下自生固氮或作為內生菌在其他植物體內固氮，為宿主植物增加獲取氮源的途徑。由此可見，莖瘤固氮根瘤菌ORS571應用于農業，具有不可替代的研究意義。

【發明內容】

本發明的目的在于，提供一種固氮效率高、具有顯著促生效果的莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株、構建方法及應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株，所述突變株為σ⁵⁴因子調控基因AZC_0343缺失的莖瘤固氮根瘤菌，其出發菌株為莖瘤固氮根瘤菌ORS571。

所述突變株通過以下方法構建得到：

(1)以莖瘤固氮根瘤菌ORS571為模板，分別以引物0343-up-F/R和引物0343-down-F/R擴增莖瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的上游片段AZC_0343-up和下游片段AZC_0343-down；

(2)酶切酶連構建重組質粒pCM351::AZC_0343up-down；

(3)將上述重組質粒導入大腸桿菌DH5α，并通過三親接合方法和同源重組原理導入莖瘤固氮根瘤菌ORS571；

(4)使用同時含有氨芐青霉素和慶大霉素抗性的TY固體培養基篩選陽性接合子，并通過PCR驗證獲得AZC_0343基因敲除的莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株。

優選地，步驟(1)中所述引物具體為：

0343-up-F：GGTACCGCTCCACGATCATCTGCTG；

0343-up-R：CATATGCCATCGAAATACTTGCCGAC；

0343-down-F：GGGCCCGTGGTGGTCTTCCGCCATG；