[發明專利]一種莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株、構建方法及應用

在審

• 申請號: 202210293436.9
• 申請日: 2022-03-23
• 公開（公告）號: CN115011534A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 解志紅;孫麗;王丹丹;殷志秋;黃煒娓;耿全政;趙紅玲
• 申請（專利權）人: 山東農業大學;山東蓬勃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12N15/66;C05F11/08;A01N63/20;A01P21/00;C12R1/41
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 周紅英

1.一種莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株，其特征在于，所述突變株為σ⁵⁴因子調控基因AZC_0343缺失的莖瘤固氮根瘤菌。

2.權利要求1所述突變株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以莖瘤固氮根瘤菌ORS571的基因組DNA為模板，分別以0343-up-F/R為引物擴增莖瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的上游片段AZC_0343-up，以0343-down-F/R為引物擴增莖瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的下游片段AZC_0343-down；

(2)酶切酶連構建重組質粒pCM351::AZC_0343up-down；

(3)將上述重組質粒導入大腸桿菌DH5α，并通過三親接合方法和同源重組原理導入莖瘤固氮根瘤菌ORS571；

(4)使用同時含有氨芐青霉素和慶大霉素抗性的TY固體培養基篩選陽性接合子，并通過PCR驗證獲得AZC_0343基因敲除的莖瘤固氮根瘤菌ORS571的突變株。

3.根據權利要求2所述的突變株的構建方法，其特征在于，步驟(1)中所述引物具體為：

0343-up-F：GGTACCGCTCCACGATCATCTGCTG；

0343-up-R：CATATGCCATCGAAATACTTGCCGAC；

0343-down-F：GGGCCCGTGGTGGTCTTCCGCCATG；

0343-down-R：GAGCTCGAGGAGCGCGTAGATGTCC。

4.根據權利要求2所述的突變株的構建方法，其特征在于，步驟(2)具體為：將步驟(1)擴增得到的所述上游片段AZC_0343-up連接到pEASY Simple上，分別用Kpn I和Nde I限制性內切酶進行酶切，收集目的片段與經Kpn I和Nde I酶切的pCM351片段連接，連接后轉入大腸桿菌篩選陽性重組子，獲得pCM351:AZC_0343-up質粒；

將步驟(1)擴增得到的下游片段AZC_0343-down連接到pEASY Simple上，分別用Apa I和Sac I限制性內切酶雙酶切AZC_0343-down片段和pCM351:AZC_0343-up質粒，收集并將經Apa I和Sac I雙酶切的AZC_0343-down片段和pCM351:AZC_0343-up質粒連接，連接后轉入大腸桿菌篩選陽性重組子，獲得重組質粒pCM351::AZC_0343up-down。

5.根據權利要求2所述的突變株的構建方法，其特征在于，步驟(3)中所述的三親接合方法具體指的是：將供體菌(含有重組質粒的DH5α)和輔助菌(含有輔助質粒pRK2013的DH5α)于TY液體培養基中培養，將受體菌(野生型莖瘤固氮根瘤菌ORS571)于LB液體培養基中培養，然后將供體菌、輔助菌和受體菌按3:2:1的體積比混合后于LB固體培養基中，于37℃條件下培養48h進行三親接合。

6.根據權利要求5所述的突變株的構建方法，其特征在于，三親接合過程中，重組質粒pCM351::AZC_0343up-down導入莖瘤固氮根瘤菌ORS571并與菌株ORS571基因組靠近，兩個DNA分子的同源序列自發進行重新組合得重組后的接合子。

7.根據權利要求6所述的突變株的構建方法，其特征在于，步驟(4)具體為：將步驟(3)得到的重組后的接合子在同時含有氨芐青霉素和慶大霉素的TY固體培養基上培養，篩選可以在同時含有氨芐青霉素和慶大霉素的TY固體培養基上生長的陽性接合子，通過PCR驗證獲得所述突變株。

8.權利要求1所述突變株在促進玉米生長中的應用。