[發(fā)明專利]一種羥基酪醇的生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210291600.2
• 申請(qǐng)日: 2022-03-23
• 公開（公告）號(hào): CN114591975B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡宇杰;燕毅;丁彥蕊;白亞軍;鄭曉暉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/54;C12N1/21;C12N15/70;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了一種羥基酪醇的生產(chǎn)方法，屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)單胺氧化酶(Monoamine oxidase)、葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase)、醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)的重組細(xì)胞或者重組細(xì)胞的組合，并通過外源添加過氧化氫酶或表達(dá)外源過氧化氫酶消除單胺氧化酶催化產(chǎn)生的過氧化氫，達(dá)到促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行的目的；本發(fā)明還通過組成型表達(dá)NAD+合成補(bǔ)救途徑中的限速酶煙酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)一步提高重組細(xì)胞或者重組細(xì)胞的組合催化多巴胺合成羥基酪醇的效率，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種羥基酪醇的生產(chǎn)方法，屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

羥基酪醇，作為一種天然的抗氧化劑，被認(rèn)為是已知最有效的天然抗氧化劑之一，主要來源于橄欖油。傳統(tǒng)的橄欖油因其具有多種對(duì)人替有益的功效，曾被歐洲地區(qū)奉為極神圣的食品，后來學(xué)者才研究出其功效的主要成分為酪醇和羥基酪醇。且于2012年左右，羥基酪醇被EC法規(guī)432/2012批準(zhǔn)為“橄欖油健康多酚”的重要組成部分，并規(guī)定橄欖油中羥基酪醇及其衍生物的含量要大于5mg/20g。由于其諸多的益處，人們給予羥基酪醇超級(jí)營養(yǎng)素的稱號(hào)。

現(xiàn)有技術(shù)中，羥基酪醇的制備主要從橄欖葉中提取、化學(xué)合成和生物合成，具體如下：

天然提取主要是從橄欖果、葉片以及在橄欖油制備過程中產(chǎn)生的殘?jiān)蛷U水中進(jìn)行的，其優(yōu)點(diǎn)是原始材料便宜且豐富，但缺點(diǎn)是使用強(qiáng)酸性水蒸氣，回收率低，且易產(chǎn)生二次污染。

Baraldi等通過過量氫化鋁鋰的還原作用，將3,4-二羥基苯乙酸還原得到羥基酪醇，但此方法原料難以獲得，工藝成本過高，不適宜工業(yè)生產(chǎn)(Preparation of 3,4-Dihydroxy-1-benzeneethanol:A Reinvestigation.Liebigs Annalen der Chemie 1983,1983(4),684-686.)。Lucia等以酪醇(4-羥基苯乙醇)為原料，在零下25攝氏度的低溫下，用2-碘酰基苯甲酸使之氧化并加入硫代硫酸鈉溶液還原得到羥基酪醇(Oxidativechemistry of the natural antioxidant hydroxytyrosol:hydrogen peroxide-dependent hydroxylation and hydroxyquinone/o-quinone couplingpathways.Tetrahedron 2006,62(6),1273-1278.)。帝斯曼公司以鄰苯二酚為原料，在酸性條件下以Pd/C催化3,4-二羥基扁桃酸，使其脫去芐位的羥基，得到3,4-二羥基苯乙酸，再利用硼氫化鉀-氯化鋰還原得到羥基酪醇(PROCESS FOR THE PREPARATION OF PHENOLICCOMPOUNDS.2006/07/05/Application date,WO2007009590,2006.)。化學(xué)合成的缺點(diǎn)使用基質(zhì)相對(duì)昂貴，并且這些過程需要保護(hù)和脫保護(hù)步驟，降低總收率；成本高、污染嚴(yán)重、安全性低，不適合應(yīng)用于食品和藥品的添加。

在生物合成領(lǐng)域，大量進(jìn)行了對(duì)羥基酪醇生物合成的研究。中國專利文獻(xiàn)CN202110546281.0通過在能夠高產(chǎn)酪醇的釀酒酵母中轉(zhuǎn)入來源于銅綠假單胞菌的HpaB和其他特定來源的HpaC，但是由于該酶的催化效率較低，且羥化酶在酵母中的表達(dá)效率低下，導(dǎo)致羥基酪醇在釀酒酵母中的產(chǎn)量較低，為1120mg/mL。中國專利文獻(xiàn)CN201711054680.5通過在大腸桿菌中過量表達(dá)氨基轉(zhuǎn)移酶、酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、羥化酶來利用酪氨酸作為底物生產(chǎn)羥基酪醇，由于在該發(fā)明中氨基轉(zhuǎn)移酶沒有提供足量氨基的受體，且羥化酶的活性太低，且該發(fā)明蛋白的可溶性表達(dá)較差，導(dǎo)致最終羥基酪醇的產(chǎn)量較低，為1469±56mg/mL。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種可利用多巴胺生產(chǎn)羥基酪醇的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌表達(dá)了單胺氧化酶、醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶。