[發明專利]一種三磷酸核苷水解酶及其純化方法和應用

在審

• 申請號: 202210289860.6
• 申請日: 2022-03-23
• 公開（公告）號: CN114645033A
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 朱斌;成銳
• 申請（專利權）人: 華中科技大學;深圳華中科技大學研究院
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/70
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 祝蓉蓉

本發明提供了一種三磷酸核苷水解酶及其純化方法和應用，屬于分子生物學技術領域。所述三磷酸核苷水解酶為GajB蛋白或GajB'蛋白，在金屬離子和DNA同時存在的條件下，使用所述三磷酸核苷水解酶水解三磷酸核苷；所述GajB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述GajB'蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述金屬離子為鎂離子、錳離子、鈣離子。本發明通過在GajB蛋白或GajB'蛋白的氨基端接入識別標簽，并選擇合適的純化方法提高了三磷酸核苷水解酶的純度。該三磷酸核苷水解酶可應用于DNA檢測、DNA加工、基因編輯、基因工程等領域。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種三磷酸核苷水解酶及其純化方法和應用。

背景技術

三磷酸核苷是核苷酸的幾種結構之一，根據核苷酸分子中的磷酸基個數，核苷酸分子結構有一磷酸核苷(NMP)、二磷酸核苷(NDP)及三磷酸核苷(NTP)。核苷是由嘌呤或嘧啶堿基與核糖形成的縮合物，這種縮合物的核糖上的五位羥基再與三聚磷酸成脂，就形成三磷酸核苷，同時，它們也是核苷酸的合成底物。三磷酸核苷是一種含有三個磷酸基團的核苷酸，自然界常見的型態包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鳥苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸胸腺苷(TTP)以及三磷酸尿苷(UTP)等。這些分子中包含一個核糖，若是將核糖替換常去氧核糖，那么會使核甘三磷酸變成去氧核苷三磷酸(dNTP)，如去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧鳥苷三磷酸(dGTP)等。

核苷三磷酸是一種分子，含有與5-碳糖結合的氮基，三個磷酸基團與糖結合。它們是DNA和RNA的構建模塊，在體內，核苷三磷酸鹽也作為細胞反應的能量來源，并參與信號傳導途徑。核苷三磷酸不能被很好的吸收，因此它們通常在細胞內合成。

三磷酸核苷水解可釋放能量，例如三磷酸腺苷(ATP)，它是由腺嘌呤、核糖和3個磷酸基團連接而成，水解時釋放出能量較多，是生物體內最直接的能量來源。ATP中的高能磷酸鍵斷裂，ATP水解成ADP+Pi(游離磷酸基團)+能量，高能磷酸鍵水解時釋放的能量多達30.54kJ/mol。因此，三磷酸核苷水解所釋放出來的能量可幫助蛋白質發揮作用，比如它可以幫助解旋酶或其他蛋白質在DNA是在DNA上移動。

2018年，Doron S等人在《Systematic discovery of antiphage defensesystems in the microbial pangenome》(Doron S,Melamed S,Ofir G,et al.Science,2018,359(6379))中報道了Gabija細菌防御系統，它包含GajA蛋白和GajB蛋白兩個組分，能有效地抵抗多種噬菌體對細菌的入侵。后續研究發現GajA蛋白和GajB蛋白對Gabija系統防御功能的發揮都是不可或缺的，二者必需協同作用。最近，GajA蛋白的功能已被解析(Chengand Zhu et al.,A nucleotide-sensing endonuclease from the Gabija bacterialdefense system.Nucleic acids research,2021,49(9))，但它的活性受核苷酸抑制且其周轉率比較差，單獨的GajA蛋白不足以抵抗噬菌體入侵，GajB可能協助或促進GajA發揮作用，共同實現破壞噬菌體入侵的目的。但GajB如何與GaiA協同工作仍不清楚，GajB的功能也未被揭示。因此，GajB功能的解析將有利于理解Gabija細菌防御系統的作用機制，也將促進GajB的開發利用和Gabija系統體外功能的實現及應用。

發明內容