[發明專利]一種三磷酸核苷水解酶及其純化方法和應用

在審

• 申請號: 202210289860.6
• 申請日: 2022-03-23
• 公開（公告）號: CN114645033A
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 朱斌;成銳
• 申請（專利權）人: 華中科技大學;深圳華中科技大學研究院
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/70
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 祝蓉蓉

1.一種三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述三磷酸核苷水解酶為GajB蛋白或GajB'蛋白，在金屬離子和DNA同時存在的條件下，使用所述三磷酸核苷水解酶水解三磷酸核苷；所述GajB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述GajB'蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述金屬離子為鎂離子、錳離子、鈣離子、鈷離子。

2.根據權利要求1所述的三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述DNA為ssDNA，所述金屬離子為鎂離子。

3.根據權利要求1所述的三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述GajB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述GajB'蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，在誘導表達所述GajB'蛋白時，直接使用所述SEQ ID No.4的核苷酸序列或將所述SEQ ID No.4的核苷酸序列的N端起始密碼子gtg更改為atg后的核苷酸序列。

4.權利要求1～3任一項所述的三磷酸核苷水解酶的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、GajB蛋白或GajB'蛋白表達：制備含有所述GajB蛋白的編碼基因或所述GajB'蛋白的編碼基因，以及識別標簽的編碼基因的重組載體；將所述重組載體轉化到感受態細胞中培養，誘導表達，經細胞裂解后收集上清液；

S2、收集目標蛋白溶液并純化：將步驟S1中得到的上清液通過鎳柱，按濃度由低到高的順序加入20～100mmol/L咪唑溶液洗脫，收集每一個濃度的咪唑溶液洗脫的蛋白液分別進行SDS-PAGE電泳檢測，收集純度較高的GajB蛋白溶液或GajB'蛋白溶液，經超濾濃縮和凝膠過濾層析后，收集洗脫峰溶液；將所述洗脫峰溶液超濾濃縮后加入透析袋中，用透析液透析3次，收集透析后的蛋白即為目標蛋白；所述凝膠過濾層析使用的洗脫液的成分包含pH＝7.5的Tris-HCl緩沖液，300mmol/L NaCl，0.5mmol/L DTT；所述透析液的成分包含pH＝7.5的Tris-HCl緩沖液，100mmol/L NaCl，1mmol/L DTT，0.5mmol/L EDTA，1v/v％Triton X-100，50v/v％甘油。

5.根據權利要求4所述的三磷酸核苷水解酶的純化方法，其特征在于，所述識別標簽為組氨酸標簽、FLAG標簽、HA標簽、SBP標簽、Avi標簽、Nus標簽、V5標簽中的任意一種。

6.根據權利要求4所述的三磷酸核苷水解酶的純化方法，其特征在于，步驟S1中所述重組載體中還包含柔性肽段的編碼基因，所述柔性肽段由1～10個氨基酸組成。

7.根據權利要求6所述的三磷酸核苷水解酶的純化方法，其特征在于，所述柔性肽段中還包含蛋白酶切位點。

8.根據權利要求4所述的三磷酸核苷水解酶的純化方法，其特征在于，步驟S1的具體方法為：將所述所述GajB蛋白的編碼基因或所述GajB'蛋白的編碼基因和所述識別標簽的編碼基因均克隆至表達載體中，得到重組載體；將所述重組載體轉化到感受態細胞中得到重組細胞，將所述重組細胞涂布于含有卡那霉素的LB培養基平板上，置于培養箱中過夜，挑取單克隆鑒定獲得的三磷酸核苷水解酶表達菌種；將所述三磷酸核苷水解酶表達菌種轉接至LB培養基中，過夜活化，按1v/v％比例稀釋后放大培養，待OD₆₀₀為0.6～0.8時，加入IPTG在10～16℃的溫度下誘導所述三磷酸核苷水解酶表達，16～20h后收集菌體，將所述菌體在5000rpm、4℃下離心15min，收集菌體沉淀，將菌體沉淀重懸于細菌裂解液中，立即于-80℃冷凍，凝固后取出置于冰上融化1h，重復凍融兩次；再在14000rpm、4℃下離心1h，離心后取上清液通過0.45μm孔徑的濾膜過濾，即得細菌裂解后的上清液；所述IPTG在培養體系中的終濃度為0.05～0.4mmol/L；所述細菌裂解液中含有pH＝7.5的Tris-HCl緩沖液、300mmol/LNaCl、0.5g/L溶菌酶、0.5mmol/L DTT。