[發明專利]一種多重基因調控下游基因檢測方法

在審

• 申請號: 202210282034.9
• 申請日: 2022-03-21
• 公開（公告）號: CN114606255A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 后加樂;王雪玲
• 申請（專利權）人: 后加樂
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 西安賽嘉知識產權代理事務所(普通合伙) 61275
• 代理人: 李迎英

本發明公開了一種多重基因調控下游基因檢測方法，在多重基因調控下游基因檢測實驗中，本發明以釀酒酵母為宿主，使用載體為雙表達框，其中第二表達框以pMET25為啟動子，通過甲硫氨酸缺陷與否來調控第二表達框基因表達與否，再通過第二表達框基因表達與否來檢測第一表達框表達基因(TF)和第二表達框表達基因(基因)的相互作用來檢測對下游基因Pro的調控。本發明技術方案成本低、工作量小、可行性高，可廣泛應用于多重基因調控下游基因檢測。

技術領域

本發明屬分子生物學技術領域，具體涉及一種多重基因調控下游基因檢測方法。

背景技術

酵母單雜交是研究蛋白質相互作用的重要方法之一。原理是：真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由一個DNA特異性結合功能域和一個或多個其他調控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結合結構域(DNA—binding domain，BD)和轉錄激活結構域(activation domain，AD)。用于酵母單雜交系統的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發揮作用。據此可將GAL4的DNA結合結構域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達的蛋白能與目的基因相互作用，同樣可通過轉錄激活結構域激活RNA聚合酶，啟動下游報告基因的轉錄，但目前還未見多重基因調控下游基因檢測方法的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種多重基因調控下游基因檢測方法，該方法操作簡單成本較低、工作量小。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施，包括如下步驟：

(1)以pBridge載體擴增Met25啟動子表達框，并通過T4連接酶連接至經NotI和NheI線性化后的pGADT7載體，重組載體命名為pGADT7-Met；

(2)將TF(轉錄因子)以同源重組的方式構建到pGADT7-Met，并與AD融合；

(3)將另一個未知基因以同源重組的方式克隆至步驟(2)載體中的Met25啟動子啟動的表達框，構建好的基因和載體命名為：pGADT7-TFMet-基因；

(4)全基因合成GAL4基因，用SacI和PteI線性化pHis載體，以同源重組方式構建至pHis2載體上，將報告基因組氨酸缺陷變為GAL4，載體命名為pGAL4；

(5)將下游基因啟動子pro構建到所構建的pGAL4載體多克隆位點處，構建好的載體命名為pGAL4-pro；

(6)pGAL4-pro轉化AH109或Y2Hgold宿主，涂布SD/-Trp平板，并檢測啟動子在酵母中內源基因的轉錄抑制濃度；

(7)將pGADT7-TFMet-基因載體轉化AH109(pGAL4-pro)或Y2Hgold(pGAL4-pro)酵母菌株，涂布SD-Trp/-Leu平板，并進行陽性克隆的篩選；

(8)將生長出來菌斑加入NaCl溶液中，并稀釋OD600值至0.01涂布到SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板和SD-Met/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板，觀察酵母生長狀態，若TF和pro相互作用，那么在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上正常生長且變藍，若TF通過基因相互作用修飾后與pro相互作用，那么在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上不生長，在SD-Met/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上生長且變藍。

采用本發明的產生的有益效果為：

本方法具有成本低、工作量較小、可行性高等優點，可廣泛應用于多重基因調控下游基因檢測。