[發明專利]一種多重基因調控下游基因檢測方法在審
| 申請號： | 202210282034.9 | 申請日： | 2022-03-21 |
| 公開（公告）號： | CN114606255A | 公開（公告）日： | 2022-06-10 |
| 發明（設計）人： | 后加樂;王雪玲 | 申請（專利權）人： | 后加樂 |
| 主分類號： | C12N15/81 | 分類號： | C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19;C12R1/865 |
| 代理公司： | 西安賽嘉知識產權代理事務所(普通合伙) 61275 | 代理人： | 李迎英 |
| 地址： | 431500 湖北*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 多重 基因 調控 下游 檢測 方法 | ||
1.一種多重基因調控下游基因檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)以pBridge載體擴增Met25啟動子表達框，并通過T4連接酶連接至經NotI和NheI線性化后的pGADT7載體，重組載體命名為pGADT7-Met；
(2)將TF以同源重組的方式構建到pGADT7-Met，并與AD融合；
(3)將另一個基因以同源重組的方式克隆至步驟(2)載體中的Met25啟動子啟動的表達框，構建好的基因和載體命名為pGADT7-TFMet-基因；
(4)全基因合成GAL4基因，用SacI和PteI線性化pHis載體，以同源重組方式構建至pHis2載體上，將報告基因組氨酸缺陷變為GAL4，載體命名為pGAL4；
(5)將下游基因啟動子pro構建到步驟(4)所構建的pGAL4載體多克隆位點處，構建好的載體命名為pGAL4-pro；
(6)pGAL4-pro轉化酵母宿主，涂布SD/-Trp平板，并檢測啟動子在酵母中內源基因的轉錄抑制濃度；
(7)將pGADT7-TFMet-基因載體轉化步驟(6)酵母菌株，涂布SD-Trp/-Leu平板，并進行陽性克隆的篩選；
(8)將步驟(7)生長出來菌斑加入NaCl溶液中，并稀釋OD600值至0.01涂布到SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板和SD-Met/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板，觀察酵母生長狀態，若TF和pro相互作用，那么在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上正常生長且變藍，若TF通過基因相互作用修飾后與pro相互作用，那么在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上不生長，在SD-Met/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上生長且變藍。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述的雙框表達載體第二表達框為Met25啟動子表達框。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述TF通過基因相互作用修飾后與pro相互作用的報告基因為GAL4。
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