[發明專利]一種基于雙鏈DNA的解旋酶活性測定方法及其應用

在審

• 申請號: 202210278487.4
• 申請日: 2022-03-21
• 公開（公告）號: CN114561442A
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 黃志紓;王佳恩;陳碩斌;譚嘉恒;吳璧含;韋力源;劉培慶
• 申請（專利權）人: 中山大學;廣州中大南沙科技創新產業園有限公司
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;C12Q1/00;G01N33/53;G01N33/58
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 齊鍵

本發明公開了一種基于雙鏈DNA的解旋酶活性測定方法及其應用，該方法主要基于由至少兩條DNA單鏈雜交得到的核酸二級結構來實現檢測。所述核酸二級結構中存在至少一條DNA單鏈的末端連接有尾序列，所述核酸二級結構中存在任意的兩條不同的DNA單鏈的末端分別連接有兩種互不干擾的特異性結合的物質或基團。本發明中的檢測方法與其他解旋酶檢測方法相比，具有更準確的解旋酶活性定量效果，且無需電泳、轉膜等繁瑣步驟，將檢測時間縮短了3～4小時，而且允許在同一溶液體系中同時檢測ATP消耗，使解旋酶活性的評估更加全面。

技術領域

本發明屬于酶活性檢測方法領域，具體涉及一種基于雙鏈DNA的解旋酶活性測定方法及其應用。

背景技術

在分子水平上，解旋酶是沿著核酸磷酸二酯骨架定向移動的馬達蛋白，并且能夠利用來自三磷酸腺苷(ATP)水解的能量解開折疊的核酸鏈。相關技術中，解旋酶的活性已被證明可以影響大多數核酸在細胞內的代謝過程，如DNA復制和修復、基因轉錄和翻譯、染色體分離和端粒維持等等。解旋酶的缺失或突變也會導致各種疾病以及癌癥易感。

生物體中有多種重要的核酸二級結構和相應的解旋酶，探索這些不同的解旋過程需要特定的研究工具。相關技術中，用于測量體外解旋酶活性的最常見測定方法是凝膠電泳遷移測定(EMSA)法、基于熒光的解旋酶活性測定方法和單分子技術。這些方法可有優勢，如凝膠電泳具有可以反映解旋過程中多種DNA底物的相對豐度；基于熒光的測定能夠實時動態檢測展開活動；單分子技術(如磁鑷、光鑷、單分子FRET(smFRET)等技術)能夠對單個核酸分子的解旋過程進行動態檢測。但是，這些方法同樣也都存在著許許多多的局限性和缺陷。EMSA只能達到半定量檢測，無法進一步實現精確定量，而且檢測方法相對繁瑣，通量低，不能實現大批量樣本的快速檢測。熒光法受制于熒光標記的使用，熒光基團只能標記在兩條DNA鏈上的特定位置，而且兩個熒光基團之間的距離必須準確設計，而這些必要的技術要求極大的限制了展開DNA底物模型的設計，使其缺乏普適性，而且，基于熒光法的測定容易受到樣品中的蛋白質的干擾，這些蛋白可能會干擾熒光團，甚至直接導致熒光猝滅，從而存在檢測不準確的問題。而單分子技術也存在使用要求高，對操作人員的要求多，技術難度高，檢測成本高，通量低的缺點，難以滿足大多數一般實驗室或者簡易檢測的使用需求，因此，迫切需要開發新的檢測方法來方便準確地定量檢測解旋酶活性。

發明內容

本發明旨在至少解決上述現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明提出一種基于雙鏈DNA的解旋酶活性測定方法及其應用。該方法能夠在不同DNA底物上檢測解旋酶的解旋活性和ATP水解活性，且可以實現高靈敏度的定量分析，檢測速度快，成本低，操作更加簡易，具有極高的實用價值。

本發明的第一個方面，提供一種檢測試劑。

根據本發明的第一個方面，在本發明的一些實施方式中，所述檢測試劑中含有由至少兩條DNA單鏈雜交得到的核酸二級結構，所述核酸二級結構中存在至少一條DNA單鏈的末端連接有尾序列，所述核酸二級結構中存在任意的兩條不同的DNA單鏈的末端分別連接有兩種互不干擾的特異性結合的物質或基團。

在本發明的一些實施方式中，所述特異性結合物質或基團包括抗體、抗原、生物素、親和素、互補配對的堿基、磁珠、轉錄激活結構域、DNA結合結構域、氨基酸、tRNA中的至少一種。

在本發明的一些優選實施方式中，所述特異性結合物質或基團為生物素和地高辛。

生物素用于將核酸二級結構固定于包被有親和素的反應容器上。在本發明的一些優選實施方式中，親和素為鏈霉親和素。

地高辛則作為中間連接物質，特異性的結合地高辛抗體，從而將可分離的B鏈與識別標記連接起來，以用于后續的定性或定量。在本發明的一些優選實施方式中，識別標記為HRP，HRP偶聯于地高辛抗體上，基于地高辛抗體與B鏈上的地高辛特異性結合，使其與B鏈連接在一起。而通過使用HRP底物(如TMB)進行顯色反應，從而能夠定量出未被解旋的核酸二級結構，從而計算得到解旋酶解旋量。