[發明專利]一種基于雙鏈DNA的解旋酶活性測定方法及其應用

在審

• 申請號: 202210278487.4
• 申請日: 2022-03-21
• 公開（公告）號: CN114561442A
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 黃志紓;王佳恩;陳碩斌;譚嘉恒;吳璧含;韋力源;劉培慶
• 申請（專利權）人: 中山大學;廣州中大南沙科技創新產業園有限公司
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;C12Q1/00;G01N33/53;G01N33/58
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 齊鍵

1.一種檢測試劑，其特征在于，所述檢測試劑中含有由至少兩條DNA單鏈雜交得到的核酸二級結構，所述核酸二級結構中存在至少一條DNA單鏈的末端連接有尾序列，所述核酸二級結構中存在任意的兩條不同的DNA單鏈的末端分別連接有兩種互不干擾的特異性結合的物質或基團；

所述特異性結合物質或基團包括抗體、抗原、生物素、親和素、互補配對的堿基、磁珠、轉錄激活結構域、DNA結合結構域、氨基酸中的至少一種。

2.根據權利要求1所述的檢測試劑，其特征在于，所述尾序列的核苷酸序列為：5’-TTTTTTTTTT-3’。

3.根據權利要求1所述的檢測試劑，其特征在于，所述DNA單鏈為12～60bp，所述DNA單鏈之間的互補配對長度大于等于12bp。

4.根據權利要求1所述的檢測試劑，其特征在于，所述核酸二級結構包括互補DNA雙鏈、復制叉結構、Holliday Junction結構、bubble結構、G4結構、hairpin結構。

5.根據權利要求4任一項所述的檢測試劑，其特征在于，所述核酸二級結構中各DNA單鏈的核苷酸序列為：

互補DNA雙鏈：

SEQ ID NO：4和13所述序列；

復制叉結構：

SEQ ID NO：1～2所述序列；或

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所述序列；或

SEQ ID NO：4～5所述序列；或

SEQ ID NO：6～7所述序列；

Holliday Junction結構：

SEQ ID NO：9～12所述序列；

bubble結構：

SEQ ID NO：8～9所述序列；

G4結構：

SEQ ID NO：13～16所述序列。

6.一種檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒中含有權利要求1～5任一項所述的檢測試劑、分別靶向權利要求1～5任一項所述的檢測試劑中的DNA單鏈上的兩種特異性結合物質或基團的物質。

7.一種定性和/或定量檢測解旋酶活性的方法，包括如下步驟：

(1)取權利要求5中各核酸二級結構的DNA單鏈，加熱退火得到對應的核酸二級結構；

(2)將核酸二級結構通過其含有的特異性結合物質或基團固定在容器表面，加入待檢測樣品和ATP反應15～30min，洗去所有溶液，加入偶聯有標記基團的靶向所述核酸二級結構特異性結合物質或基團的物質，通過對比空白對照的參數變化情況定性和/或定量解旋酶活性。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述參數為吸光度值，所述變化情況基于如下公式計算得到：

式中，A(f)是加入解旋酶前的核酸二級結構的吸光度值，A(t)是加入解旋酶后的核酸二級結構的吸光度值，A(u)是未形成核酸二級結構前的DNA單鏈混合液的吸光度值，Q(ds)是原始DNA鏈的負載量。

9.一種檢測解旋酶ATP消耗量的方法，包括如下步驟：

(1)取權利要求5中各核酸二級結構的DNA單鏈，加熱退火得到對應的核酸二級結構；

(2)將核酸二級結構通過其含有的特異性結合物質或基團固定在容器表面，加入待檢測樣品和ATP反應25～40min，得到混合反應液；

(3)通過檢測混合反應液中的ATP殘余量計算得到解旋酶ATP消耗量。

10.權利要求1～5任一項所述的檢測試劑在如下(1)～(4)任一項中的應用；

(1)定性或定量檢測解旋酶活性；

(2)定性或定量檢測解旋酶ATP消耗情況；

(3)篩選調控解旋酶或解旋酶解旋活性的物質；

(4)篩選具有解旋特定核酸二級結構解旋活性的物質。