[發明專利]一種同時檢測BVDV和BEV的試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202210277766.9
• 申請日: 2022-03-16
• 公開（公告）號: CN114606346A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 史慧君;付強;李丹;馬雪連;姚剛;楊莉;權冉;葛麗娟;塞力克·杰恩斯;王雨
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 西安鼎邁知識產權代理事務所(普通合伙) 61263
• 代理人: 劉喜保

1.一種同時檢測BVDV和BEV的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有特異性引物和探針組合，包括以下2對特異性引物和2條特異探針，其核苷酸序列分別為：

BVDV上游引物：5’-TCAGGTTAAGATGTGCTTTGGG-3’，

BVDV下游引物：5’-CAGGGTAGTCGTCAGTGGTT-3’，

BVDV探針：5’-FAM-TGCCCTCGTCCACGTGGCAT-BHQ1-3’；

BEV上游引物：5’-CGCAATGGTCAAGCACTTCT-3’，

BEV下游引物：5’-GGCCATACTAGGCTTCTCGT-3’，

BEV探針：5’-HEX-CGCCCAGCGTCGTTACCCGC-BHQ1-3’。

2.如權利要求1中所述的一種用于同時檢測BVDV和BEV的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括：(1)如權利要求1中所述的兩套引物和探針；(2)2×ddPCR SuperMixforProbes；(3)RNase-Free ddH₂O；(4)待檢測樣品的cDNA；(5)微滴生成油；(6)微滴發生卡；(7)微滴發生卡密封膠墊；(8)96孔PCR反應板；(9)熱封箔膜。

3.如權利要求1中所述的一種同時檢測BVDV和BEV的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取待檢樣品的總RNA，反轉錄為cDNA；

(2)配置ddPCR反應體系，并加入待檢樣品的cDNA；

(3)微滴的生成；

(4)微滴PCR擴增反應；

(5)反應結束后，機器讀取熒光信號，自動計算目的基因含量；樣品檢測結果≥1copies/μL判斷為陽性，樣品檢測結果＜1copies/μL判斷為陰性。

4.如權利要求3中所述的一種同時檢測BVDV和BEV的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述雙重ddPCR反應總體系為20μL，其中包括：(1)2×ddPCR SuperMix forProbes 10μL；(2)兩套上、下游引物分別加450nM；(3)兩種探針分別加250nM；(4)待檢cDNA模板2μL；(5)RNase-Free ddH₂O補足至20μL。

5.如權利要求3中所述的一種同時檢測BVDV和BEV的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述微滴PCR擴增反應條件為：95℃預變性10min；94℃變性30s，58℃退火1min，40個循環；98℃10min；4℃終止反應，升降溫速率2℃/s。

6.如權利要求1至權利要求5中任意一項所述的一種同時檢測BVDV和BEV的試劑盒在同時檢測BVDV和BEV中的應用。

7.如權利要求1至權利要求5中任意一項所述的一種同時檢測BVDV和BEV試劑盒的使用方法在同時檢測BVDV和BEV中的應用。