[發(fā)明專利]一種同時(shí)檢測(cè)BVDV和BEV的試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210277766.9
• 申請(qǐng)日: 2022-03-16
• 公開（公告）號(hào): CN114606346A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史慧君;付強(qiáng);李丹;馬雪連;姚剛;楊莉;權(quán)冉;葛麗娟;塞力克·杰恩斯;王雨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 西安鼎邁知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61263
• 代理人: 劉喜保

本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N能夠同時(shí)檢測(cè)BVDV和BEV的試劑盒，通過創(chuàng)造性的提出基于BVDV和BEV基因序列的特異性引物和探針，并集合特定的使用方法；試劑盒高靈敏度，可以對(duì)低豐度的目的基因進(jìn)行檢測(cè)，能夠檢測(cè)出現(xiàn)有技術(shù)中無法檢測(cè)出的低豐度樣本；能夠直接定量，自動(dòng)分析出結(jié)果，不依賴Ct值，不用建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；快速高效、操作簡便、重復(fù)性好。通過應(yīng)本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)試劑盒，為有效防控BVDV和BEV提供技術(shù)支持，能夠促進(jìn)犢牛腹瀉病防治，對(duì)于養(yǎng)牛業(yè)具有巨大的潛在開發(fā)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種病毒檢測(cè)試劑盒的技術(shù)領(lǐng)域，更具體的涉及一種同時(shí)檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒和牛腸道病毒的試劑盒與應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrheavirus，BVDV)，屬于黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，電鏡下觀察可見病毒顆粒呈球形，直徑約25-30nm。BVDV是1946年在美國最早被發(fā)現(xiàn)，后來在英國的牛場(chǎng)也出現(xiàn)了BVDV。我國學(xué)者李佑民于1980年從流產(chǎn)胎牛的脾臟中成功分離并鑒定出BVDV，隨著我國養(yǎng)牛業(yè)快速發(fā)展，該病分布廣泛，新疆、山東、內(nèi)蒙古、北京、黑龍江等地均有該病發(fā)生的報(bào)道。該病毒主要通過持續(xù)感染導(dǎo)致腸細(xì)胞原發(fā)性損傷、易感動(dòng)物共感染和在隱窩腸細(xì)胞中復(fù)制、病變兩種方式引起犢牛腹瀉。還可通過胎盤傳播，引發(fā)胚胎死亡、流產(chǎn)、免疫耐受、出生缺陷、新生犢牛羸弱。牛病毒性腹瀉病癥傳染性極強(qiáng)，感染該病的宿主范圍也愈加廣泛，大部分偶蹄家畜均會(huì)感染。這種病癥的危害狀況極為嚴(yán)重，一旦爆發(fā)，難以控制和徹底消滅，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展。

牛腸道病毒(Bovine enterovirus，BEV)屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，是一種無囊膜的單股正鏈RNA病毒。自1959年由美國學(xué)者M(jìn)oll和Davis首次分離到BEV以來，許多國家和地區(qū)也報(bào)道了該病的暴發(fā)與流行。李英利等于2011年首次在我國一腹瀉犢牛體內(nèi)分離到1株F種腸道病毒。BEV傳播的方式主要為糞-口途徑傳播，也可通過飛沫傳播，病毒在呼吸道或消化道進(jìn)行復(fù)制，再通過糞便排毒，病毒可在環(huán)境中存活3-4個(gè)月。BEV的臨床癥狀廣泛，包括腸道感染(高發(fā)病率、腹瀉和中度死亡率)，呼吸道疾病(咳嗽、發(fā)熱和呼吸困難)，生殖障礙(流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡)和不孕，BEV還可引起牛的隱性感染，并隨感染犢牛糞便排出體外。BEV呈世界性流行，在我國屬于新發(fā)病，目前已遍布多個(gè)省市，但相關(guān)BEV的檢測(cè)方法匱乏。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、病毒的分離鑒定、免疫熒光技術(shù)(IFA)等，但是這些方法存在著操作復(fù)雜、耗時(shí)過長、特異性差、靈敏度低等問題。目前針對(duì)上述病毒的檢測(cè)常用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)等方法。但PCR需通過凝膠分析檢測(cè)結(jié)果，靈敏度低，且無法定量；qPCR在定量時(shí)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，而標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量易受到引物和探針濃度、DNA純度以及標(biāo)準(zhǔn)品等因素的影響，導(dǎo)致其準(zhǔn)確度達(dá)不到絕對(duì)定量的要求，對(duì)混合感染和低病毒載量的臨床樣本無法有效檢出。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)目前致犢牛腹瀉的主要病毒危害養(yǎng)牛業(yè)和現(xiàn)有檢測(cè)方法不足的問題，本發(fā)明旨在提供一種具有靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確度和精確度高，可實(shí)現(xiàn)精確定量，能夠同時(shí)檢測(cè)出BVDV和BEV的檢測(cè)試劑盒。通過應(yīng)用該試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)便利、快速、高效、靈敏、痕量、特異、絕對(duì)定量的對(duì)BVDV和BEV進(jìn)行檢測(cè)的方法，該試劑盒為后續(xù)對(duì)這兩種病毒的預(yù)防、早期診斷、及時(shí)防控和凈化具有重要意義。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于同時(shí)檢測(cè)BVDV和BEV的試劑盒，所述試劑盒中含有特異性引物和探針組合，包括以下2對(duì)特異性引物和2條特異探針，其核苷酸序列分別為：

BVDV上游引物：5’-TCAGGTTAAGATGTGCTTTGGG-3’，