[發明專利]一種總同型半胱氨酸的電化學免疫檢測方法

在審

• 申請號: 202210275824.4
• 申請日: 2022-03-21
• 公開（公告）號: CN114577875A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 賈冬玲;張宜凡;趙芳;劉敏敏
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: G01N27/30
• 分類號: G01N27/30;G01N27/327;G01N33/68
• 代理公司: 杭州知閑專利代理事務所(特殊普通合伙) 33315
• 代理人: 朱朦琪

本發明公開了一種總同型半胱氨酸的電化學免疫檢測方法，包括：SAH電化學免疫傳感器的制備、繪制工作曲線與總同型半胱氨酸的檢測三步。該檢測方法以納米復合材料為原料，依次經鏈霉親和素、生物素化的SAH抗體的修飾及牛血清蛋白溶液封閉制備電化學免疫傳感器；再利用該電化學免疫傳感器，基于SAH抗體與SAH抗原特異性反應引起電信號的變化的原理，對待測樣品中的同型半胱氨酸進行檢測，最終獲得樣品中總同型半胱氨酸的含量，具有檢測時間短和更高的靈敏度、準確性和特異性等優勢，實現了快速、準確、高靈敏、簡單價廉的檢測tHcy，且無需大型檢測設備，有望實現小型智能化和床旁快速簡便檢測。

技術領域

本發明涉及電化學分析技術和免疫學的技術領域，尤其涉及一種總同型半胱氨酸的電化學免疫檢測方法。

背景技術

同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是一種天然存在的含硫氨基酸，為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產物，部分以同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物存在，微量以還原型同型半胱氨酸存在，大部分通過二硫鍵與白蛋白結合而存在。大量對Hcy的研究表明，Hcy是動脈粥樣硬化和血栓形成等心腦血管疾病及血管栓塞性疾病發病的獨立危險因素。遺傳、飲食營養等因素異常會引起Hcy積累過多，大幅增加一些疾病如高胱氨酸尿癥、唐氏綜合癥、阿爾茨海默病、心血管疾病、先天畸形以及維生素缺乏癥等的發病風險。因此，快速、準確、高靈敏、簡單而廉價的檢測生物體中總同型半胱氨酸(Total Homocysteine,tHcy)水平，對于疾病預防和病理研究具有十分重要的意義。

目前，臨床常用的檢測tHcy的方法主要有兩大主流方法：一是循環酶法，通過循環反應放大檢測信號，增強反應靈敏度。其原理是樣本中同型半胱氨酸被轉化成游離型(還原型)后，利用S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)在同型半胱氨酸甲基轉移酶(Homoeysteine Methyltransferase,HMTase)作用下將血漿或血清中Hcy轉化生成(S-adenonsyl-homocysteine,SAH)，SAH又在SAH水解酶(SAHhydrolase,SAHase)作用下脫掉腺苷(Ado)水解為Hcy；水解生成的Hcy也會在SAM及HMTase作用下，生成SAH，生成的SAH又會繼續啟動反應，形成循環的反應，每循環一次，腺苷生成的量疊加放大，腺苷通過水解生成氨和次黃嘌呤，在谷氨酸脫氫酶的作用下，生成的氨會使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)轉化為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，樣本中的Hcy濃度與NADH轉化速率成正比，該法是利用酶促反應及NADH的變化來檢測同型半胱氨酸濃度。該方法雖然重復性好，但易受血清中氨離子的干擾，特異性和準確性略差，并且反應過程中需要好幾種酶進行循環放大，試劑的穩定性的影響因素增多，同時操作過程復雜、成本高昂、使用非常不便、耗時、需要高昂的檢測設備，不利于各級醫院的推廣普及。

另一種主要檢測方法是熒光偏振免疫檢測法，其檢測原理為先用二硫鍵還原劑將生物樣本中結合態的同型半胱氨酸還原成游離形式后，加入腺苷，在S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶(SAHase)的作用下，同型半胱氨酸轉化為S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)。然后，加入SAH單克隆抗體和熒光標記的SAH抗原，SAH與熒光標記抗原競爭結合SAH抗體，形成大分子免疫復合物，最后測定其熒光偏正強度。但是，上述檢測產品使用繁瑣且需要專業的設備進行檢測，不利于小型智能化和床旁快速簡便檢測。

電化學傳感器具有快速、靈敏和價廉等優點，在床邊診斷中扮演很重要的角色。目前，已有文獻報道了基于金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極的同型半胱氨酸電化學傳感(分析科學學報，2020，36(6):775-781.)，該電化學傳感器是基于金納米粒子-石墨烯復合材料對同型半胱氨酸的電化學氧化原理對同型半胱氨酸進行定量檢測，雖然取得了較好的線性范圍和檢測靈敏度，但是同型半胱氨酸在該電化學傳感電極上的氧化峰電位為0.46V(飽和甘汞電極為參比電極)，其他共存生物分子也易在該電位下被氧化造成干擾。在實際樣本中，通常半胱氨酸、谷胱甘肽等生物分子與同型半胱氨酸共存，這些生物硫醇分子也會在該電位下被氧化，從而影響對同型半胱氨酸定量檢測的準確性和可靠性。