[發(fā)明專利]間歇浸沒(méi)式荔浦芋組培苗快速增殖的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210271081.3
• 申請(qǐng)日: 2022-03-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114467758A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周思菊;李家文;李玉洪;莫星煜;趙曉美;文愛(ài)忠;邱巧玲;潘玲華;楊海娟;田云建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 重慶聚為捷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50297
• 代理人: 李闖

1.間歇浸沒(méi)式荔浦芋組培苗快速增殖的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：建立間歇浸沒(méi)液體培育系統(tǒng)，包括：基本培養(yǎng)基、激素配比、外植體大小和培養(yǎng)容器；

S2：選擇符合荔浦芋組培苗快速生長(zhǎng)的光質(zhì)：以一葉狀莖帶一芽為外植體，分別置于玫瑰紅(600-690nm)、橙紅色(590一650nm)、黃色(530-600nm)，綠色(490-550nm)、藍(lán)色(400-460nm)，5種不同波長(zhǎng)光質(zhì)下培養(yǎng)(白光為對(duì)照)，觀察不同波長(zhǎng)光質(zhì)對(duì)荔浦芋組培苗增殖的影響，其中玫瑰紅光質(zhì)對(duì)誘導(dǎo)荔浦芋組培苗形成有效分蘗的增殖效果最佳且產(chǎn)生的分蘗苗的質(zhì)量也最好，經(jīng)過(guò)50d培養(yǎng)分蘗數(shù)可高達(dá)68.5，繁殖系數(shù)達(dá)68.5/3-22.8；

S3：觀察不同糖濃度和水楊酸對(duì)荔浦芋組培苗生長(zhǎng)及移栽成活率：在荔浦芋組培苗增殖過(guò)程中：10％的蔗糖濃度是最有利于荔浦芋組培苗增殖，其增殖系數(shù)為9.4，而當(dāng)培養(yǎng)基糖濃度為12％時(shí)，荔浦芋組培苗生長(zhǎng)質(zhì)量最好，苗壯且移栽成活率大大提高，2-3mg/L的SA與10％的蔗糖配合使用效果最好，此時(shí)荔浦芋組培苗增殖效果顯著，形成的叢芽壯，大小整齊-致，而且可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的荔浦芋原球莖；

S4：所述間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)包括：培養(yǎng)瓶、儲(chǔ)液瓶、蠕動(dòng)泵，所述儲(chǔ)液瓶通過(guò)硅膠軟管與培養(yǎng)瓶連接，通過(guò)蠕動(dòng)泵的作用將液體培養(yǎng)基從儲(chǔ)液瓶抽到培養(yǎng)瓶，再?gòu)呐囵B(yǎng)瓶抽回儲(chǔ)液瓶；所述培養(yǎng)瓶包括容器主體以及密封蓋體，所述密封蓋體頂部設(shè)有兩個(gè)軟管通孔；

S5：接種與繼代增殖培養(yǎng)：(1)繼代培養(yǎng)中不定芽增殖的最適培養(yǎng)基為:1/2MS(220mg/LCaCl22H2O)，+6-BA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+NAA0.4mg/L+750mg/L CH，增殖系數(shù)為4.11,芽苗整齊健壯；

(2)繼代培養(yǎng)中擬球莖誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為:MS(440mg/L CaCl-2H2O)+6-BA1.0mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.4mg/L+500mg/L CH,CLS的誘導(dǎo)率為80％左右，球莖基部直徑較大，芽苗健壯；

其中，荔浦芋外植體制備方法如下：取荔浦芋莖尖分生組織培養(yǎng)，并將誘導(dǎo)出的不定芽切為單芽或雙芽，剝離老葉，并保留芽體1～2cm，即得，荔浦芋外植體的接種密度為：每升培養(yǎng)液中接種10～15株外植體；

繼代培養(yǎng)條件為：溫度28±1℃，光照1500Lx，12小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗，設(shè)定間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器的相關(guān)參數(shù)，同時(shí)間歇培養(yǎng)的間歇頻率為每4小時(shí)一次，培養(yǎng)時(shí)間為5分鐘，培養(yǎng)時(shí)間30天。

S4：生根培養(yǎng)：繼代增殖培養(yǎng)結(jié)束后，將間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基替換為生根液體培養(yǎng)基，并繼續(xù)進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)條件為：溫度28±1℃，光照1500Lx，14小時(shí)光照，10小時(shí)黑暗，設(shè)定間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器的相關(guān)參數(shù)，即間歇培養(yǎng)的間歇頻率為每6小時(shí)一次，培養(yǎng)時(shí)間為3分鐘，培養(yǎng)時(shí)間20天為宜；

S5：生根苗移栽：生根培養(yǎng)結(jié)束后，將所得組培生根苗移栽至培養(yǎng)杯中育苗，并將所得種苗移栽至田地，生根苗放入滅菌后的潮土基質(zhì)，在5～6℃環(huán)境中煉苗7～10d最佳，移栽時(shí)選擇潮土和河沙混合基質(zhì)(8:2體積比)，成活率達(dá)96％，出苗率為86％，組培苗就地栽培或移至原產(chǎn)地均可，成活率均高于95％，出苗率大于92％。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間歇浸沒(méi)式荔浦芋組培苗快速增殖的方法，其特征在于，所述繼代增殖液體培養(yǎng)基屬于對(duì)來(lái)自于外植體所增殖的培養(yǎng)物(包括細(xì)胞、組織或其切段)通過(guò)更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進(jìn)行連續(xù)多代的培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間歇浸沒(méi)式荔浦芋組培苗快速增殖的方法，其特征在于，所述繼代增殖液體培養(yǎng)基為添加有無(wú)土栽培營(yíng)養(yǎng)液、Pbo、IBA以及白砂糖的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間歇浸沒(méi)式荔浦芋組培苗快速增殖的方法，其特征在于，所述Pbo的濃度為4mg/L，所述白砂糖的濃度為30g/L，所述IBA的濃度為0.2mg/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間歇浸沒(méi)式荔浦芋組培苗快速增殖的方法，其特征在于，所述生根液體培養(yǎng)基為添加有Hg、DDT、Cd以及白砂糖的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基；