[發明專利]一種檢測重金屬汞離子的乳膠微球免疫層析試紙條及其應用

在審

• 申請號: 202210268689.0
• 申請日: 2022-03-18
• 公開（公告）號: CN114518449A
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 凌素美;董明科;汪世華;王榮智;賈坤志;徐楊;徐愛迪;聶宇姣
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/577;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/532;G01N33/53;C07K16/44;C12N5/20
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 彭琴;蔡學俊

1.一種檢測重金屬汞離子的乳膠微球免疫層析試紙條，其特征在于：所述乳膠微球免疫層析試紙條包括以下組分：塑料外殼、樣品墊、免疫探針結合墊、硝酸纖維膜和吸水墊；所述免疫探針結合墊滴加有抗汞離子單克隆抗體標記的乳膠微球免疫探針；所述抗汞離子單克隆抗體是抗Hg²⁺-ITCBE半抗原鼠源雜交瘤細胞株7A1分泌的單克隆抗體，鼠源雜交瘤細胞株7A1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日期為2021年11月23日，保藏號為CGMCC No.23879。

2.根據權利要求1所述的一種檢測重金屬汞離子的納米花免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）抗汞離子單克隆抗體標記的乳膠微球免疫探針的制備：

1）取20 μL乳膠微球懸濁液于1.5mL EP管中，再加入pH為6.0的MES緩沖液 1 mL，懸浮微球，于4 ℃ 12000rpm離心10 min；

2）棄上清，用1 mL pH為6.0的MES緩沖液重懸沉淀，后加入1 mg EDC于重懸液中；

3）將步驟2）中重懸液放于25 ℃ 160 rpm恒溫搖床條件下震蕩反應15 min，注意要混勻，不然有結塊，說明實驗失敗；

4）取出步驟3）中活化后的乳膠微球懸液，12000 rpm 4 ℃條件下離心10 min，然后棄上清；

5）加入0.5 mL pH為6.5的50 g/L甘氨酸溶液，懸浮沉淀，后加入15 μL抗Hg²⁺-ITCBE單克隆抗體，在室溫條件下置于160 rpm搖床孵育2 h；

6）孵育完成后取出于4℃ 12000 rpm條件下離心10 min，棄上清，同樣條件下洗滌一次；

7）加入0.5 mL甘氨酸于室溫160 rpm條件下震蕩30 min用于淬滅微球；

8）取出于4℃ 12000rpm條件下離心10 min，以同樣條件下再清洗一次；

9）棄上清，沉淀用50μL重懸液吹起，制得抗汞離子單克隆抗體標記的乳膠微球免疫探針免疫探針，置于4℃備用；所述重懸液的組成為：0.5% BSA+0.5% 甘氨酸+5% 海藻糖+1×PBS緩沖液稀釋的0.5vol% Tween-20；

（2）免疫探針結合墊與樣品墊的預處理：將未處理的免疫探針結合墊和樣品墊用剪刀剪成寬1.3 cm的長條狀，將其置于大培養皿中，用提前配好的封閉液淹沒，隨后轉移到37℃恒溫培養箱封閉2 h，從培養箱取出后濾去封閉液并繼續置于培養箱烘干，烘干后4 ℃保存；后續使用按照長為1.3 cm，寬為4 mm裁剪；所述封閉液的組成為：5wt% BSA+1vol %Tween-20；

（3）NC膜劃線：取羊抗鼠二抗在NC膜上進行劃C線，最終劃在C線上羊抗鼠二抗的含量為0.4 ng/cm，經過裁剪后，每張寬4 mm的卡條上劃線羊抗鼠二抗的含量為0.16 ng；取完全抗原Hg²⁺-ITCBE-BSA在NC膜上進行劃T線劃線，最終劃在T線上完全抗原Hg²⁺-ITCBE-BSA的含量為0.025 ng/cm，經過裁剪后，每張寬4 mm的卡條上劃線完全抗原Hg²⁺-ITCBE-BS的含量為0.01 ng，在同一張NC膜上，C、T線之間距離為0.5 cm；

（4）免疫探針結合墊的制備：在預處理后的免疫探針結合墊上滴加2μL步驟（1）制備的抗汞離子單克隆抗體標記的乳膠微球免疫探針；

（5）免疫層析試紙條的組裝：將步驟（3）劃線后的NC膜、步驟（4）制備的免疫探針結合墊、步驟（2）預處理的樣品墊、吸水墊，依次組裝在底板上；其中免疫探針結合墊和樣品墊重疊交錯粘貼，同端相隔2 mm，吸水墊與NC膜首尾重疊2 mm，蓋上塑料外殼蓋子，干燥封裝，置4 ℃保存。

3.一種檢測重金屬汞離子的納米花免疫層析試紙條在檢測重金屬汞離子中的應用。