[發明專利]一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法

在審

• 申請號: 202210259774.0
• 申請日: 2022-03-16
• 公開（公告）號: CN114606175A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 劉寧鴿;馬海杰;梁慧玲;孫學鵬;徐海仁;黃素亞;孟心月;李通;徐燕娜
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/10;C07K1/14;C07K1/34;C07K1/36
• 代理公司: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙) 11489
• 代理人: 邵娟

本發明公開了一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，包括如下步驟：配置好所需裂解液和滅菌相關容器；將柑橘幼嫩的葉片材料迅速用液氮浸沒固定，快速充分研磨，加入到裂解液中充分混勻；使用Miracloth分離細胞核與其他非核材料；離心過濾液，不同大小離心管離心參數有差異,離心整個過程中，通過處理過的寬口槍頭吸打，逐步分離葉綠體等雜質，對細胞核與其他非核材料進行精細分離，最終得到所需質量和濃度的細胞核；本發明中所提供的柑橘細胞核提取方法，使用范圍廣，可適用于十余種柑橘品種，能夠去除葉綠體污染又對細胞核破壞較低，細胞核的純度得到提高，且提取濃度高。

技術領域

本發明涉及柑橘細胞核提取技術領域，具體涉及一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法。

背景技術

植物細胞非對稱融合、染色體雜交育種、大片段基因組文庫構建、DNA纖維制備、細胞核中DNA、RNA、蛋白質含量的分析及染色質結構分析等，需要分離純化出較多個體完整，分散較好的細胞核。學者們曾嘗試用不同方法進行植物細胞核的分離，比如大豆、玉米、水稻、煙草、小麥、棉花、長春花、杉木等細胞核的分離或純化近來又有過報道，但由于不同植物材料由于結構和組分的不同，所以適合一種植物的細胞核制備方法并不適合于其它植物。

因此，為提高柑橘細胞核提取效率，亟需提供一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，以解決上述背景技術中提出的問題，普遍適用于十余種柑橘品種，所提細胞核完整性好，濃度高，步驟簡便，3-4小時便可獲取結果。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，包括如下步驟：

S1、配置好所需裂解液和滅菌相關容器；

S2、將柑橘幼嫩的葉片材料迅速用液氮浸沒固定，快速充分研磨，加入到裂解液中充分混勻；

S3、使用Miracloth分離細胞核與其他非核材料；

S4、離心過濾液，不同大小離心管離心參數有差異：

首先，使用50mL離心管調整到高轉速5000rpm以盡量增加細胞核的回收率；

其次，將10mL離心管降低到中轉速3000rpm以盡量分離非核材料；

最后，將1.5mL離心管降低到低轉速2000rpm以減少細胞核的破碎率；離心整個過程中，通過處理過的寬口槍頭吸打，逐步分離葉綠體等雜質，對細胞核與其他非核材料進行精細分離，最終得到所需質量和濃度的細胞核。

其中，所述裂解液包括HB(homogenization buffer)stock 10×(100mL)、HB 1×solution(1000mL)、Triton X-100(100mL)和NIB(nuclear isolation buffer)。

其中，所述HB(homogenization buffer)包括1.21g Trizma base、5.96gKCL、20mL0.5M EDTA、0.255g Spermidine和0.348g Spermine，使用雙蒸水補充到100mL，調節pH至9-9.4，可在4℃的玻璃瓶中保存1年。

其中，所述HB 1×solution(1000mL)包括100mL 10×HB和171.2g蔗糖(sucrose)，使用雙蒸水補充到700mL，直至完全溶解，補充到最終體積1000mL，可在4℃的玻璃瓶中保存三個月。

其中，所述Triton X-100(100mL)包括20mL Triton X-100、10mL 10×HB和17.15g蔗糖(sucrose)，使用雙蒸水補充到60mL，直至完全溶解，補充到最終體積100mL，可在4℃的玻璃瓶中保存一年。