[發明專利]一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法

在審

• 申請號: 202210259774.0
• 申請日: 2022-03-16
• 公開（公告）號: CN114606175A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 劉寧鴿;馬海杰;梁慧玲;孫學鵬;徐海仁;黃素亞;孟心月;李通;徐燕娜
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/10;C07K1/14;C07K1/34;C07K1/36
• 代理公司: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙) 11489
• 代理人: 邵娟

1.一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、配置好所需裂解液和滅菌相關容器；

S2、將柑橘幼嫩的葉片材料迅速用液氮浸沒固定，快速充分研磨，加入到裂解液中充分混勻；

S3、使用Miracloth分離細胞核與其他非核材料；

S4、離心過濾液，不同大小離心管離心參數有差異：

首先，使用50mL離心管調整到高轉速5000rpm以盡量增加細胞核的回收率；

其次，將10mL離心管降低到中轉速3000rpm以盡量分離非核材料；

最后，將1.5mL離心管降低到低轉速2000rpm以減少細胞核的破碎率；離心整個過程中，通過處理過的寬口槍頭吸打，逐步分離葉綠體等雜質，對細胞核與其他非核材料進行精細分離，最終得到所需質量和濃度的細胞核。

2.根據權利要求1所述的一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于：所述裂解液包括HB stock 10×(100mL)、HB 1×solution(1000mL)、Triton X-100(100mL)和NIB。

3.根據權利要求2所述的一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于：所述HB包括1.21g Trizma base、5.96gKCL、20mL 0.5M EDTA、0.255g Spermidine和0.348gSpermine，使用雙蒸水補充到100mL，調節pH至9-9.4。

4.根據權利要求2所述的一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于：所述HB 1×solution(1000mL)包括100mL 10×HB和171.2g蔗糖(sucrose)，使用雙蒸水補充到700mL，直至完全溶解，補充到最終體積1000mL。

5.根據權利要求2所述的一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于：所述Triton X-100(100mL)包括20mL Triton X-100、10mL 10×HB和17.15g蔗糖(sucrose)，使用雙蒸水補充到60mL，直至完全溶解，補充到最終體積100mL。

6.根據權利要求2所述的一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于：所述NIB包括97.5mL 1×HB、2.5mL Triton X-100mix和250μLβ-巰基乙醇(β-mercaptoethanoL)，在使用前立即加入1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)攪拌直至溶解。

7.根據權利要求1所述的一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于：所述步驟S4中的寬口槍頭為1mL剪口槍頭，利用寬口槍頭輕輕懸浮底部綠色沉淀，避免氣泡和泡沫產生，繼續冰上裂解30min。

8.根據權利要求1所述的一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于：所述步驟S2中的研磨采用研缽，使用前，先用液氮提前預冷。

9.根據權利要求1所述的一種應用于多品種的柑橘細胞核提取方法，其特征在于：所述步驟S3中的Miracloth為一種孔徑22－25μm的聚酯人造纖維濾布，使用時，將其放置于漏斗上，折疊成3-5層，通過重力作用過濾進50mL離心管。