[發明專利]一種基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A適配體試紙條的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202210259358.0
• 申請日: 2022-03-16
• 公開（公告）號: CN115097115A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 陳秀金;張敏;高棟;牛華偉;柳家鵬;張勛;郭金英;關隨霞;李兆周;王耀;曹力
• 申請（專利權）人: 河南科技大學;山東美正生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;C12Q1/6832
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

本發明公開一種基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A適配體試紙條的制備方法及應用，屬于納米生物檢測領域。制備方法包括以下步驟：（1）PAMAM?AuNPs偶聯物的制備，（2）PAMAM?AuNPs?aptamer探針的制備，（3）結合墊的制備，（4）適配體互補鏈DNA1和DNA2與鏈霉親和素復合物的制備，（5）T線和C線的制備，（6）試紙條的組裝。本發明利用PAMAM樹狀大分子的末端具有多個活性基團，連接多個金納米粒子，提高適配體試紙條的靈敏度，并通過Image J軟件讀取試紙條上顯色帶的光密度值，實現試紙條的半定量分析。

技術領域

本發明屬于納米生物檢測技術領域，具體涉及一種基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A適配體試紙條的制備方法及應用。

背景技術

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是一種由曲霉屬和青霉屬的某些產毒菌株產生的次級代謝產物，廣泛存在于咖啡、啤酒、紅酒、葡萄汁、玉米、小麥、蔬菜、肉類和肉制品中，具有很高的化學穩定性和熱穩定性，在人體內易于吸收，但代謝非常緩慢，其半衰期超過30天。研究表明，它對人體和動物具有腎毒性、肝毒性、致畸、致癌和免疫抑制作用。為了更好地監控食品中的OTA含量，亟需建立快速、準確和靈敏地檢測食品中OTA的方法。目前，檢測OTA的儀器分析方法主要包括高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、氣相色譜-質譜法等。盡管這些方法靈敏度和準確性高，但檢測時需要專業人員操作昂貴的大型儀器，而且制備樣品的過程復雜。酶聯免疫分析和免疫層析法不需要大型儀器，但是需要依賴抗體，抗體合成周期較長，價格高且抗體活性不穩定。

和抗體相比，適配體（aptamer）具有識別靶物質的范圍廣、特異性強、易修飾、穩定性好、可在常溫下運輸、易獲得和成本低的優勢，已廣泛用于適配體側流層析技術。據報道[1]，用于金標OTA適配體側流層析試紙條的定性檢出限可以達到1 ng/mL，半定量檢出限低至0.18 ng/mL。但是，膠體金弱的光學性能，低的生物分子結合率，導致傳統的金標側流層析試紙的靈敏度較低，難以滿足食品介質中痕量危害物的快速分析。PAMAM樹狀分子由烷基二胺和叔胺支鏈組成，具有高的結構柔韌性、親水性、良好的生物相容性、高的機械穩定性和化學穩定性，并且在其分子末端具有大量的胺基，可固定多個納米粒子，目前，尚沒有關于PAMAM增敏的適配體側流層析試紙條的研究。因此，本專利擬構建一種基于PAMAM增敏的金標適配體側流層析試紙條。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A適配體試紙條的制備方法及應用。

為了實現上述目的，本發明提供以下技術方案：

一種基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A適配體試紙條的制備方法，所述制備方法如下所示：

（1）PAMAM-AuNPs偶聯物的制備

量取濃縮后的AuNPs溶液，加入0.1 mol/L K₂CO₃溶液調pH至8.0-9.0，然后加入濃度為50μM的PAMAM溶液，室溫下反應5 h，以12000 rpm離心20 min，再用超純水重懸，4℃儲存備用；

（2）PAMAM-AuNPs-aptamer探針的制備

將濃度為100 μM的適配體溶液加入到PAMAM-AuNPs偶聯物中，加入80 mM的NaCl溶液至終濃度為50 mM，在室溫下避光孵育48 h，以10000 rpm離心18 min后，加pH 8.0-9.0的PB緩沖溶液洗滌兩次，加入偶聯物復溶液重懸，最后在4℃條件下保存。

（3）結合墊的制備

將制備的PAMAM-AuNPs-aptamer探針通過劃膜噴金儀噴于聚酯纖維素膜上，37℃烘干并于避光條件下儲存備用；所述聚酯纖維素膜預先用結合墊處理液進行處理；

（4）適配體互補鏈DNA1和DNA2與鏈霉親和素復合物的制備