[發(fā)明專利]一種基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A適配體試紙條的制備方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210259358.0
• 申請日: 2022-03-16
• 公開（公告）號: CN115097115A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳秀金;張敏;高棟;牛華偉;柳家鵬;張勛;郭金英;關(guān)隨霞;李兆周;王耀;曹力
• 申請（專利權(quán)）人: 河南科技大學(xué);山東美正生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;C12Q1/6832
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

1. 一種基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A適配體試紙條的制備方法，其特征在于，所述制備方法如下所示：

（1）PAMAM-AuNPs偶聯(lián)物的制備

量取濃縮后的AuNPs溶液，加入0.1 mol/L K₂CO₃溶液調(diào)pH至8.0-9.0，然后加入濃度為50μM的PAMAM溶液，室溫下反應(yīng)5 h，以12000 rpm離心20 min，再用超純水重懸，4℃儲存?zhèn)溆茫?/p>

（2）PAMAM-AuNPs-aptamer探針的制備

將濃度為100 μM的適配體溶液加入到PAMAM-AuNPs偶聯(lián)物中，加入80 mM的NaCl溶液至終濃度為50 mM，在室溫下避光孵育48 h，以10000 rpm離心18 min后，加pH 8.0-9.0的PB緩沖溶液洗滌兩次，加入偶聯(lián)物復(fù)溶液重懸，最后在4℃條件下保存；

結(jié)合墊的制備

將制備的PAMAM-AuNPs-aptamer探針通過劃膜噴金儀噴于聚酯纖維素膜上，37℃烘干并于避光條件下儲存?zhèn)溆茫凰鼍埘ダw維素膜預(yù)先用結(jié)合墊處理液進(jìn)行處理；

適配體互補(bǔ)鏈DNA1和DNA2與鏈霉親和素復(fù)合物的制備

將鏈霉親和素溶解于pH 7.4、0.01 mol/L PBS 緩沖液中，取40 μL、1 mg/mL鏈霉親和素分別加入到40 μL適配體互補(bǔ)鏈DNA1和DNA2中，然后加入20 μL、0.01 mol/L PBS緩沖溶液，4℃下孵育2 h；

T線和C線的制備

使用劃膜噴金儀將互補(bǔ)鏈DNA1和DNA2與鏈霉親和素復(fù)合物分別噴在硝酸纖維素膜上作為T線和C線；

試紙條的組裝

將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙依次固定在聚乙烯底板上，然后切成3.5 mm寬，密封干燥保存；其中所述樣品墊預(yù)先用樣品墊處理液進(jìn)行處理。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，

步驟（2）所述的適配體核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具體為：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH-3’。

3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）所述的偶聯(lián)物復(fù)溶液為：含有0.5%聚乙二烯、5%蔗糖、1%OVA、0.25% 吐溫-20的0.01 mol/L PB緩沖溶液。

4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）所述的結(jié)合墊處理液為：含有4% 蔗糖、1% OVA和0.25% 吐溫20的0.1 mol/L PBS緩沖溶液。

5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（4）所述的互補(bǔ)鏈DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，

具體為：5’-Biotin-TGTCCGATGCTCCCTTTACGCCACCCACACCCGATC-3’。

6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（4）所述的互補(bǔ)鏈DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，

具體為：5’-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（6）所述的樣品墊處理液為：含有2%蔗糖、0.25% 吐溫-20的0.01 mol/L PBS緩沖溶液。

8.權(quán)利要求1-7任一項所述的制備方法制得的試紙條。

9.權(quán)利要求8所述的試紙條在OTA檢測中的應(yīng)用。