[發(fā)明專利]一種快速檢測牛結核病的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202210254251.7 | 申請日： | 2022-03-15 |
| 公開（公告）號： | CN114657271A | 公開（公告）日： | 2022-06-24 |
| 發(fā)明（設計）人： | 樊曉旭;張浩博;劉婷婷;亓菲;孫翔翔;劉蒙達;田莉莉;孫明軍;董雅琴;焉鑫;付樹芳;孫世雄;遲慶安;馮淑芳;仵國政;張培培;魏潤宇;王毓秀;邵衛(wèi)星;孫淑芳;范偉興 | 申請（專利權）人： | 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/32 |
| 代理公司： | 北京識然知識產權代理事務所(普通合伙) 11975 | 代理人： | 曾慶國 |
| 地址： | 266032 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 快速 檢測 結核病 方法 | ||
1.一種快速檢測牛結核病的擴增用引物對和探針，其特征在于，所述引物對用于檢測序列為SEQ ID NO:1的片段，探針檢測所述引物擴增的產物。
2.如權利要求1所述的擴增用引物和探針，其特征在于，所述的引物對中的上游引物的序列為SEQ ID NO：2；下游引物的序列為SEQ ID NO：3。
3.如權利要求1所述的擴增用引物和探針，其特征在于，所述的探針的序列為SEQ IDNO：4。
4.如權利要求3所述的擴增用引物和探針，其特征在于，所述的探針的所述探針采用熒光報告基團和熒光淬滅基團進行修飾。
5.如權利要求4所述探針采用熒光報告基團和熒光淬滅基團進行修飾，熒光報告基團修飾在探針序列離5′端堿基數30bp的位置上；熒光淬滅基團修飾在探針序列離3′端堿基數18bp的位置上，熒光報告基團與淬滅基團之間間隔了3個堿基CAG，其中A用四氫呋喃殘基替換。
6.如權利要求5所述的擴增用引物和探針，其特征在于，所述的述熒光報告基團為FAM；熒光淬滅基團為BHQ1。
7.一種RAA熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包含有權利要求1-6任一項所述的擴增用引物和探針。
8.一種基于重組酶等溫擴增熒光法快速檢測動物布魯氏菌病的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟：
1)提取待檢測對象的核酸樣品；
2)將恒溫熒光基因檢測儀接通電源進行預熱，對反應參數進行設置；反應參數設置為39℃，反應時間：20分鐘；
3)在25μL反應緩沖液中加入13.7μL水，濃度為15μM的2.1μL權利要求1-6任一項所述的擴增用引物和0.6μL探針，充分混合后添加到RAA熒光基礎反應試劑中混合，得到反應預混液；
4)在反應管蓋上加2.5μL的Mg2+，將4μL所述步驟1)中得到的核酸樣品與所述步驟3)中得到的反應預混液充分混合，得到的反應體系放入恒溫熒光基因檢測儀檢測熒光信號；
5)根據RAA-F1610檢測儀器中的陽性判定方法，選擇閾值的方法來判定曲線的陰陽性；在設置自動閾值為300，定性閾值為200，則在20分鐘內，熒光值大于300的孔位會被判定為陽性，其余判定為陰性。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用濃度為1～50μM；探針的濃度為1～50μM。
10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用濃度為10μM；探針的濃度為10μM。
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