[發明專利]一種誘導ipsc分化為心肌細胞的方法

在審

• 申請號: 202210253482.6
• 申請日: 2022-03-15
• 公開（公告）號: CN114525242A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 胡俊;程亞婷;歐陽佳;李穎;陳志毅;蘇雨晴;袁天立;林寶怡
• 申請（專利權）人: 武漢百翼生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/074
• 代理公司: 深圳泛航知識產權代理事務所(普通合伙) 44867
• 代理人: 鄧愛軍

本發明公開了一種誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，涉及生物技術領域。所述方法包括以下步驟：S1ipsc細胞培養；S2誘導ipsc分化為心肌細胞。使用干細胞培養基培養ipsc生長至80％后，使用混合培養基培養，誘導ipsc分化呈中胚層前體細胞，然后再用抑制劑培養基培養，將細胞分化成類似心肌前體細胞，最后再用維持培養基培養，得到心肌細胞，所述混合培養基為含有Chir99021和白術內酯Ⅱ的基礎培養基，所述基礎培養基為含B27添加劑、LAA2P的RPMI 1640培養基；所述抑制劑培養基為含有Wnt?C59的基礎培養基；所述維持培養基為基礎培養基。本發明誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，具有分化時間短(3天即可見分化出跳動的心肌細胞)，分化效率高(7天分化效率高達85％)的優點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種誘導ipsc分化為心肌細胞的方法。

背景技術

目前治療心臟疾病的終末發展階段—心力衰竭的最后手段仍為移植。然而，因供體資源嚴重短缺而導致很多患者在等待中死亡。iPSC-CM方法的出現為這一現狀帶來新希望，其主要長期目標是轉變臨床上從供體獲得心肌組織治療受損心臟這一現狀。

胚胎早期心血管系統發育相關的基因調控網絡是心肌分化的理論基礎。近10年致力于干細胞心肌分化的研究多采用階段特異性激活或抑制不同的信號通路，通過調控重現上述心肌發育的關鍵節點實現最終分化的目的。用于心肌分化的干細胞有兩種培養方式，一種是形成 EB(embryoid body)球，一種是單層培養的多潛能干細。后者也有鋪基質膠培養干細胞和通MEF 飼養層培養干細胞兩種方法。早期的培養體系以KSR(knockout ser-umreplacement)作為基礎培養體系，分化過程中添加BMP4，FGF2，Activin A等因子促進分化。隨后，培養體系更換為 RPMI 1640和B27添加劑，并且簡化培養體系將因子調控信號通路轉換為小分子調控。培養體系逐漸向無動物源成分且成分明確、簡單、高效的方向轉變，這主要為臨床心肌移植的最終目標打下基礎。

然而，目前上述誘導ipsc分化為心肌細胞的方法分化時間長，分化效率仍然較低。

發明內容

本發明提供的一種誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，旨在解決上述背景技術中存在的問題。

為了實現上述技術目的，本發明主要采用以下技術方案：

一種誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，所述方法包括以下步驟：

S1 ipsc細胞培養：將iPSC克隆在包被過Matrigel的培養皿中培養，待回合度達70％～80％時，吸走干細胞培養基,然后進行洗滌、傳代培養，37℃孵育3～5min；

S2誘導ipsc分化為心肌細胞：使用干細胞培養基培養ipsc生長至80％后，使用混合培養基培養，誘導ipsc分化呈中胚層前體細胞，然后再用抑制劑培養基培養，將細胞分化成類似心肌前體細胞，最后再用維持培養基培養，得到心肌細胞；

所述混合培養基為含有Chir99021和白術內酯Ⅱ的基礎培養基，所述基礎培養基為含B27 添加劑、LAA2P的RPMI 1640培養基；

所述抑制劑培養基為含有Wnt-C59的基礎培養基；

所述維持培養基為基礎培養基。

本發明中，所述步驟S1中，經過孵育培養后，還加入新鮮的干細胞培養基，吹打成細胞懸液，按1:4～1:8接種在96孔培養板中培養，放在生物安全柜中，蓋上蓋子，室溫下靜置1 小時，使培養板完全、均勻地包被Matrigel，然后將細胞置于5％CO₂的37℃恒溫培養箱培養，關閉搖床蓋子，控制搖擺速度≤200r/min。

本發明中，所述步驟S1中，包被過Matrigel的培養皿為采用1：150～250稀釋的matrigel 工作液完全覆蓋培養皿，并于37℃靜置過夜。