[發明專利]一種誘導ipsc分化為心肌細胞的方法

在審

• 申請號: 202210253482.6
• 申請日: 2022-03-15
• 公開（公告）號: CN114525242A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 胡俊;程亞婷;歐陽佳;李穎;陳志毅;蘇雨晴;袁天立;林寶怡
• 申請（專利權）人: 武漢百翼生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/074
• 代理公司: 深圳泛航知識產權代理事務所(普通合伙) 44867
• 代理人: 鄧愛軍

1.一種誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

S1 ipsc細胞培養：將iPSC克隆在包被過Matrigel的培養皿中培養，待回合度達70％～80％時，吸走干細胞培養基，然后進行洗滌、傳代培養，37℃孵育3～5min；

S2誘導ipsc分化為心肌細胞：使用干細胞培養基培養ipsc生長至80％后，使用混合培養基培養，誘導ipsc分化呈中胚層前體細胞，然后再用抑制劑培養基培養，將細胞分化成類似心肌前體細胞，最后再用維持培養基培養，得到心肌細胞；

所述混合培養基為含有Chir99021和白術內酯Ⅱ的基礎培養基，所述基礎培養基為含B27添加劑、LAA2P的RPMI 1640培養基；

所述抑制劑培養基為含有Wnt-C59的基礎培養基；

所述維持培養基為基礎培養基。

2.根據權利要求1所述的誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，其特征在于：所述步驟S1中，經過孵育培養后，還加入新鮮的干細胞培養基，吹打成細胞懸液，按1:4～1:8接種在96孔培養板中培養，放在生物安全柜中，蓋上蓋子，室溫下靜置1小時，使培養板完全、均勻地包被Matrigel，然后將細胞置于5％CO₂的37℃恒溫培養箱培養，關閉搖床蓋子，控制搖擺速度≤200r/min。

3.根據權利要求1所述的誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，其特征在于：所述步驟S1中，包被過Matrigel的培養皿為采用1:150～250稀釋的matrigel工作液完全覆蓋培養皿，并于37℃靜置過夜。

4.根據權利要求1所述的誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，其特征在于：所述步驟S1中，采用無鈣鎂的PBS溶液洗滌。

5.根據權利要求1所述的誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，其特征在于：所述步驟S1中，使用0.5mmol/L EDTA傳代培養，培養時輕輕搖動培養瓶，使EDTA鋪滿所有細胞表面，待細胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現象時，倒掉EDTA，再繼續作用2-3分鐘，輕輕搖動，細胞層可隨殘留的EDTA呈片狀從瓶壁上脫落下來，當通過顯微鏡下發現細胞回縮變圓，細胞間隙增大時，應立即終止消化，然后再加入完全培養基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作輕柔，不要用力過大，避免出現泡沫和細胞的機械損傷；最后用計數板計數，計算細胞的濃度，并用完全培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。

6.根據權利要求1所述的誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，其特征在于：所述步驟S2中，混合培養基中，Chir99021的濃度為4.6～5.8μmol/L，白術內酯Ⅱ的濃度為5.3～6.3mol/L，所述基礎培養基為含有2％的B27添加劑、64μg/L LAA2P的RPMI 1640培養基。

7.根據權利要求1所述的誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，其特征在于：所述抑制劑培養基中，Wnt-C59的濃度為1～3μmol/L。

8.根據權利要求1所述的誘導ipsc分化為心肌細胞的方法，其特征在于：所述混合培養基的培養時間為48h，所述抑制劑培養基的培養時間為48h，所述維持培養基培養時，需每兩天換液直至心肌開始搏動。