[發(fā)明專利]一種從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210244798.9
• 申請(qǐng)日: 2022-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN114574524A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市體內(nèi)生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C40B50/06;C12N9/22;C12N15/113;C12N15/12;C12N5/10;C12Q1/02;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 劉二艷

本發(fā)明提供了一種從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法及其應(yīng)用，所述方法包括如下步驟：(1)制備CRISPR?Cas9慢病毒和sgRNA文庫(kù)慢病毒；(2)使用CRISPR?Cas9慢病毒轉(zhuǎn)染永生化肝細(xì)胞構(gòu)建CRISPR?Cas9穩(wěn)定株；(3)使用sgRNA文庫(kù)慢病毒轉(zhuǎn)染所述CRISPR?Cas9穩(wěn)定株，得到sgRNA文庫(kù)慢病毒感染的永生化肝細(xì)胞；(4)將所述sgRNA文庫(kù)慢病毒感染的永生化肝細(xì)胞移植到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，通過(guò)所述sgRNA文庫(kù)慢病毒感染的永生化肝細(xì)胞篩選肝癌抑癌基因。通過(guò)所述方法篩選到的肝癌抑癌基因在肝癌藥物篩選和/或藥效評(píng)價(jià)中的具有重要應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

在全球范圍內(nèi)，肝癌是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，在新發(fā)病例數(shù)量方面排名第六。肝癌的5年生存率僅為18％，是胰腺癌之后死亡率排名第二的致死性腫瘤。由于肝臟是一類高度異質(zhì)性的組織結(jié)構(gòu)，肝癌也成了一類十分復(fù)雜的腫瘤。臨床上，許多患者被確診時(shí)已處于晚期，而現(xiàn)有的臨床治療方案都難以有效提高患者的生存率。因此，急需新的生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)來(lái)有效地治療這種疾病。

目前，基因篩選已被廣泛應(yīng)用于肝癌的驅(qū)動(dòng)基因的篩選中。轉(zhuǎn)座子和慢病毒的隨機(jī)插入突變可以誘導(dǎo)基因功能的增加或減少，能快速地識(shí)別肝癌的驅(qū)動(dòng)基因，然而轉(zhuǎn)座子和慢病毒的隨機(jī)插入存在偏好性，因此，這類正向遺傳篩選存在局限性。短發(fā)夾RNA(shRNAs)的RNA干擾篩選也被用于肝癌的研究，然而shRNA文庫(kù)不能達(dá)到基因組規(guī)模的覆蓋，而且RNA干擾不能完全敲除目的基因。

新一代基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9以其操作簡(jiǎn)單和通用的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，成為了開展正向遺傳學(xué)篩選實(shí)驗(yàn)的強(qiáng)有力的工具。利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立與某類功能相關(guān)的sgRNA文庫(kù)，通過(guò)功能性篩選、富集、PCR擴(kuò)增及深度測(cè)序分析篩選功能相關(guān)的基因。目前，利用全基因組范圍敲除的篩選系統(tǒng)存在細(xì)胞量的限制，其中原代肝臟細(xì)胞雖為最理想的肝細(xì)胞源，但其保存成本較高，難以體外擴(kuò)增，其來(lái)源短缺同時(shí)涉及倫理問(wèn)題，因此，不適合作為修飾細(xì)胞進(jìn)行篩選。

基于肝癌轉(zhuǎn)化的全基因組篩選研究仍局限于鼠源化肝臟細(xì)胞、肝癌細(xì)胞系或轉(zhuǎn)分化類肝細(xì)胞，雖然動(dòng)物源性肝細(xì)胞的來(lái)源較廣，且具有正常肝細(xì)胞的功能，但是有發(fā)生免疫排斥及異種來(lái)源的反轉(zhuǎn)錄病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，腫瘤肝細(xì)胞也存在有致瘤風(fēng)險(xiǎn)和肝功能不足等缺陷。

目前常用的小鼠肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)模型主要有化學(xué)誘導(dǎo)、移植和基因修飾等類型。這類小鼠HCC模型可以在原位誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生，但存在穩(wěn)定性差、造模周期長(zhǎng)和非人源化模型的局限性。

因此，開發(fā)一種新的理想的肝細(xì)胞源和全基因組篩選肝癌抑制基因的方法，篩選獲得新的生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)，對(duì)肝癌的臨床治療具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法及其應(yīng)用。通過(guò)所述從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法能夠篩選獲得新的生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)，通過(guò)所述方法篩選到13種肝癌抑癌基因，對(duì)肝癌的臨床治療具有重要意義；本發(fā)明還提供了一種適用性廣的轉(zhuǎn)化肝細(xì)胞為永生化肝細(xì)胞的方法，所述方法可以實(shí)現(xiàn)人肝細(xì)胞的體外大量擴(kuò)增，同時(shí)還可保留其正常肝細(xì)胞功能，所述方法制備的永生化肝細(xì)胞是新的理想的肝細(xì)胞源，能夠作為篩選肝癌抑癌基因的工具細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種以非疾病診斷和/或治療為目的從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法，所述從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法包括如下步驟：

(1)制備CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文庫(kù)慢病毒；

(2)使用CRISPR-Cas9慢病毒轉(zhuǎn)染永生化肝細(xì)胞構(gòu)建CRISPR-Cas9穩(wěn)定株；