[發(fā)明專利]一種從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法及其應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202210244798.9 | 申請日： | 2022-03-14 |
| 公開（公告）號： | CN114574524A | 公開（公告）日： | 2022-06-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 不公告發(fā)明人 | 申請（專利權(quán)）人： | 深圳市體內(nèi)生物醫(yī)藥科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C40B50/06;C12N9/22;C12N15/113;C12N15/12;C12N5/10;C12Q1/02;C12Q1/6886 |
| 代理公司： | 北京品源專利代理有限公司 11332 | 代理人： | 劉二艷 |
| 地址： | 518102 廣東省深圳市*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基因組 篩選 肝癌 基因 方法 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種以非疾病診斷和/或治療為目的從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，所述從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法包括如下步驟：
(1)制備CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文庫慢病毒；
(2)使用CRISPR-Cas9慢病毒轉(zhuǎn)染永生化肝細胞構(gòu)建CRISPR-Cas9穩(wěn)定株；
(3)使用sgRNA文庫慢病毒轉(zhuǎn)染所述CRISPR-Cas9穩(wěn)定株，得到sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞；
(4)將所述sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞移植到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，通過所述sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞篩選肝癌抑癌基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以非疾病診斷和/或治療為目的從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文庫慢病毒的制備方法包括如下步驟：
分別將含有CRISPR-Cas9基因的慢病毒表達質(zhì)粒和含有sgRNA文庫的慢病毒表達質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞，分別得到CRISPR-Cas9慢病毒和sgRNA文庫慢病毒；
優(yōu)選地，所述含有CRISPR-Cas9基因的慢病毒表達質(zhì)粒包括lenti-Cas9-Blast質(zhì)粒；
優(yōu)選地，所述sgRNA文庫包括GeCKOv2.0；
優(yōu)選地，所述病毒包裝質(zhì)粒包括psPAX2質(zhì)粒和pMD2.G質(zhì)粒；
優(yōu)選地，所述包裝細胞包括293T細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以非疾病診斷和/或治療為目的從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述使用CRISPR-Cas9慢病毒轉(zhuǎn)染永生化肝細胞構(gòu)建CRISPR-Cas9穩(wěn)定株包括如下步驟：
將所述CRISPR-Cas9慢病毒接種于永生化肝細胞培養(yǎng)液中孵育，進行抗生素篩選，得到CRISPR-Cas9穩(wěn)定株；
優(yōu)選地，所述永生化肝細胞培養(yǎng)液的細胞密度為(1～2)×106cells/mL；
優(yōu)選地，所述CRISPR-Cas9慢病毒的MOI為0.7以下；
優(yōu)選地，所述抗生素包括殺稻瘟菌素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的以非疾病診斷和/或治療為目的從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述使用sgRNA文庫慢病毒轉(zhuǎn)染所述CRISPR-Cas9穩(wěn)定株，得到sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞包括如下步驟：
將所述sgRNA文庫慢病毒接種于所述CRISPR-Cas9穩(wěn)定株培養(yǎng)液中，孵育，抗生素篩選，得到sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞；
優(yōu)選地，所述CRISPR-Cas9穩(wěn)定株培養(yǎng)液的細胞密度為(2～2.5)×106cells/mL；
優(yōu)選地，所述sgRNA文庫慢病毒的MOI為0.3以下；
優(yōu)選地，所述抗生素包括嘌呤霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項所述的以非疾病診斷和/或治療為目的從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，步驟(4)中，將所述sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞移植到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，通過所述sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞篩選肝癌抑癌基因包括如下步驟：
將所述sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞移植到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，收集腫瘤細胞，分別對所述sgRNA文庫慢病毒感染的永生化肝細胞和腫瘤細胞進行基因組DNA分析，根據(jù)sgRNA的差異倍數(shù)篩選肝癌抑癌基因；
優(yōu)選地，所述免疫缺陷的小鼠包括NSI小鼠；
優(yōu)選地，所述篩選肝癌抑癌基因的標(biāo)準(zhǔn)為sgRNA的差異倍數(shù)在8以上，對應(yīng)的基因為肝癌抑癌基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項所述的以非疾病診斷和/或治療為目的從全基因組中篩選肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，所述永生化肝細胞的構(gòu)建方法包括如下步驟：
(a)制備含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒；
(b)用所述含TP53R249S基因和MYC基因的慢病毒轉(zhuǎn)染正常人肝細胞，構(gòu)建永生化肝細胞。
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