[發明專利]同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的核酸組合物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 202210244238.3
• 申請日: 2022-03-14
• 公開（公告）號: CN114438265B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 王利麗;李秀麗;江珊;鄢明華;路超;張莉;任衛科;董志民;田向學;朱琪;李富強
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的核酸組合物、試劑盒及檢測方法。本發明屬于豬病原檢測技術領域，具體涉及同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的核酸組合物、試劑盒及檢測方法。本發明提供的所述核酸組合物能夠特異性識別豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒，利用所述核酸組合物建立的三重熒光定量PCR檢測方法，具有快速、方便、高效、靈敏度高的特點，可廣泛應用于豬腹瀉病流行病學調查、實驗室鑒別檢測和相關科學研究，具體很高的實際應用價值。

技術領域

本發明屬于豬病原檢測技術領域，具體涉及同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的核酸組合物、試劑盒及檢測方法。

背景技術

近年來，豬腹瀉病的流行越來越廣，且疾病的復雜程度日益增加，給我國畜牧業造成了嚴重的經濟損失。豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic?diarrhea?virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritis?virus，TGEV)和豬輪狀病毒(Porcinerotavirus，PoRV)是引起豬腹瀉的三種重要的病毒性病原。近年來不斷報道有新的腹瀉病原出現，導致豬腹瀉病原復雜化，鑒別檢測困難。

豬德爾塔冠狀病毒(Porcine?delta?coronavirus，PDCoV)又稱豬丁型冠狀病毒，屬冠狀病毒科德爾塔冠狀病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。該病毒可感染不同日齡的豬，感染率約為20％～30％，主要引起嘔吐、腹瀉、脫水等臨床癥狀。哺乳仔豬對其易感性較強，臨床癥狀更加嚴重，感染后病死率高達50％～100％。

哺乳動物呼腸孤病毒(Mammalian?orthoreovirus，MRV)是廣泛傳播并感染幾乎所有哺乳動物，且通常具有低致病性。包括人類、水貂、豬、牛、蝙蝠和狗等，具有人畜共患性。2005年曾智勇等(曾智勇,郭萬柱,徐志文,宋振輝,殷華平,王新,王小玉.仔豬腹瀉糞樣中豬呼腸孤病毒的分離鑒定,畜牧獸醫學報2007,38(6):574～580)從疑似“冬痢”的仔豬腹灣糞樣中檢出呼腸孤病毒，預示豬呼腸孤病毒可能與該類疾病有關，對豬具有一定的致病性。因此，快速檢測該病原能為該病的早期防控提供科學依據。

豬嵴病毒(Porcinekobuvirus，PKV)是小RNA病毒科嵴病毒屬成員，該病毒主要危害3周齡以下的仔豬，可引起仔豬胃腸炎，出現嚴重腹瀉，甚至死亡。國內從2009年開始PKV陽性檢出率呈逐年遞增的趨勢。PKV與其他病毒混合感染現象也較普遍，同時還會加重病情，其感染也不僅僅局限于腸道，從而導致所謂的“疫苗使用效果不佳”。

目前檢測豬腹瀉病病原的方法有病毒分離與鑒定、血清學方法及分子生物學方法等，豬腹瀉病引起的癥狀均以腹瀉為特征，僅依據臨床癥狀和流行病學很難進行鑒別診斷，因此必須依靠實驗室檢測技術。其中病毒分離、血清學技術等常用診斷技術均存在操作復雜，難度較大等問題，并且很難在疾病早期得出診斷結論；而血清學方法準確率較低，單一PCR方法檢測效率低。因此，針對豬腹瀉病病原建立一種敏感、快速、高效的能同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、哺乳動物呼腸孤病毒和豬嵴病毒三種病原的方法是豬腹瀉病病原快速鑒別與早期防控的關鍵。

發明內容

本發明的目的在于提供同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的核酸組合物、試劑盒及檢測方法，采用本發明提供的核酸組合物可以同時快速、方便、高效地檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒這三種病原，提高檢測靈敏度。

本發明提供了一種同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的核酸組合物，包括針對豬德爾塔冠狀病毒的正向引物PDCoV-F、反向引物PDCoV-R和探針PDCoV-P，針對豬嵴病毒的正向引物PKV-F、反向引物PKV-R和探針PKV-P以及針對呼腸孤病毒的正向引物MRV-R、反向引物MRV-R和探針MRV-P；

所述針對豬德爾塔冠狀病毒的正向引物序列如SEQ?ID?NO.1所示；