[發明專利]同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的核酸組合物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 202210244238.3
• 申請日: 2022-03-14
• 公開（公告）號: CN114438265B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 王利麗;李秀麗;江珊;鄢明華;路超;張莉;任衛科;董志民;田向學;朱琪;李富強
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

1.一種同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的核酸組合物，其特征在于，包括針對豬德爾塔冠狀病毒的正向引物PDCoV-F、反向引物PDCoV-R和探針PDCoV-P，針對呼腸孤病毒的正向引物PKV-F、反向引物PKV-R和探針PKV-P以及針對豬嵴病毒的正向引物MRV-R、反向引物MRV-R和探針MRV-P；

所述針對豬德爾塔冠狀病毒的正向引物序列如SEQ?ID?NO.1所示；

所述針對豬德爾塔冠狀病毒的反向引物序列如SEQ?ID?NO.2所示；

所述針對豬德爾塔冠狀病毒的探針序列如SEQ?ID?NO.3所示；

所述針對呼腸孤病毒的正向引物序列如SEQ?ID?NO.4所示；

所述針對呼腸孤病毒的反向引物序列如SEQ?ID?NO.5所示；

所述針對呼腸孤病毒的探針序列如SEQ?ID?NO.6所示；

所述針對豬嵴病毒的正向引物序列如SEQ?ID?NO.7所示；

所述針對豬嵴病毒的反向引物序列如SEQ?ID?NO.8所示；

所述針對豬嵴病毒的探針序列如SEQ?ID?NO.9所示。

2.根據權利要求1所述的核酸組合物，其特征在于，所述針對豬德爾塔冠狀病毒的探針序列、針對呼腸孤病毒的探針序列以及針對豬嵴病毒的探針序列的5’端均采用熒光報告基團修飾，3’端均采用熒光淬滅基團修飾。

3.根據權利要求2所述的核酸組合物，其特征在于，所述針對豬德爾塔冠狀病毒的探針序列的5’端、針對呼腸孤病毒的探針序列的5’端以及針對豬嵴病毒的探針序列的5’端分別采用不同熒光波長的報告基團修飾。

4.一種同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1～3任一所述的核酸組合物。

5.權利要求1～3任一所述的核酸組合物或權利要求4所述的試劑盒在制備同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的產品中的應用。

6.一種同時檢測豬德爾塔冠狀病毒、呼腸孤病毒和豬嵴病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

提取檢測樣本的總RNA，反轉錄得cDNA；

以所述cDNA模板，利用權利要求1～3任一項所述的核酸組合物進行熒光PCR反應，并收集熒光信號及Ct值，當Ct值大于36時判定為陰性。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述熒光PCR反應的反應體系以25μL計包括：12.5μL?2×Premix?Ex?Taq，10μmol/L?PDCoV-F、PDCoV-R、PKV-F、PKV-R、MRV-F和MRV-R各0.5μL～1.4μL，10μmol/L?PDCoV-P、PKV-P和MRV-PcDNA各0.3μL～0.8μL，4μL?cDNA和余量的水。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述熒光PCR反應的程序為：第一階段95℃預變性3min；第二階段94℃變性10s，55.8℃延伸30s，共40個循環，在延伸階段收集熒光信號。