[發明專利]一種聯合檢測谷胱甘肽和ATP的熒光生物傳感器

在審

• 申請號: 202210241163.3
• 申請日: 2022-03-11
• 公開（公告）號: CN114609106A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 黃加棟;姚玉穎;王玉;劉素;郭志強;朱志學;李靜靜;張清心;徐婉晴;李宗強;朱鏡儒;李倩茹
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/00
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 牛芳

本發明屬于生物檢測技術領域，提供了一種聯合檢測谷胱甘肽和ATP的熒光生物傳感器，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1?4所示的連接探針L、掛鎖探針M、ATP block鏈、報告探針S和Mg²⁺、phi29 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP；所述的掛鎖探針M的5’端磷酸化處理；所述ATP block鏈第8位、第9位修飾二硫鍵，3’端修飾Inverted dT；所述報告探針S第13位、第14位為核糖核苷酸；第13位前修飾熒光淬滅基團，第14位后修飾熒光報告基團。本發明的傳感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優點，實現了一種方法對雙目標物的聯合檢測，可以彌補現有檢測方法的缺陷與不足，實現對快速、準確的定量檢測。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種聯合檢測谷胱甘肽和ATP的熒光生物傳感器。

背景技術

三磷酸腺苷（ATP）是生物體內一種重要的生物分子，是參與細胞合成必不可少的能量來源，對各種生命活動中具有重要影響。谷胱甘肽（GSH）是一種哺乳動物體內含量較為豐富的含巰基的三肽類物質，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，其具有抗氧化、清除自由基以及調控重要的細胞內的生理過程的能力。

在癌細胞ATP合成過程中，異常數量的活性氧(ROS)作為激活氧化應激的副產物產生。為了防止過量ROS的致命作用，癌細胞產生大量的谷胱甘肽(GSH)來應對的氧化還原應激，并使腫瘤進展。鑒于ATP和GSH之間的相互相關性，能夠關聯它們檢測的工具需要深入了解。

目前，檢測ATP的方法有電化學法、表面增強拉曼散射法等，檢測谷胱甘肽的方法有比色法、雙光子發射法等，但它們都存在耗時、儀器昂貴、操作復雜等缺點并且少見關聯GSH和ATP相關性的檢測方法。因此，開發一種雙變量、快速且靈敏檢測ATP、谷胱甘肽的方法，對疾病檢測具有重要意義。

發明內容

針對現有技術中的問題，本發明提供一種聯合檢測谷胱甘肽和ATP的熒光生物傳感器，檢測限低、特異性好。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案。

一種聯合檢測谷胱甘肽和ATP的熒光生物傳感器，包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-4所示的連接探針L、掛鎖探針M、ATP block鏈、報告探針S和Mg²⁺、phi29 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP；

所述的掛鎖探針M的5’端磷酸化處理；

所述ATP block鏈第8位、第9位修飾二硫鍵，3’端修飾Inverted dT；

所述報告探針S第13位、第14位為核糖核苷酸；第13位前修飾熒光淬滅基團，第14位后修飾熒光報告基團。

優選地，所述連接探針L、掛鎖探針M和T4 DNA連接酶以環狀模板代替。

所述環狀模板的構建方法，包括以下步驟：

將掛鎖探針M與連接探針L在T4 DNA連接酶緩沖液中雜交，然后加入T4 DNA連接酶低溫下反應，然后滅活T4 DNA連接酶；純化后得環形模板。

優選地，所述生物傳感器還包括緩沖溶液；更為優選地，所述緩沖溶液中包含Mg²⁺。

一種包含上述熒光生物傳感器的檢測谷胱甘肽和ATP的試劑盒。

優選地，所述試劑盒還包括谷胱甘肽和ATP的標準樣品。

一種采用上述生物傳感器或者試劑盒檢測谷胱甘肽和ATP的方法，包括以下步驟：

（1）連接探針L和掛鎖探針M在T4 DNA連接酶的催化下獲得環狀模板；

（2）環狀模板、Mg²⁺、phi29 DNA聚合酶、dNTP、ATP block鏈、報告探針S在緩沖液中30℃孵育；然后滅活phi29 DNA聚合酶；